本文選題：毛花獼猴桃根　切入點：TEOA　出處：《浙江大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：近年來,結(jié)腸癌發(fā)病率呈現(xiàn)明顯的逐年增長趨勢,成為人類高發(fā)惡性腫瘤之一。手術是其治療的首選方法,但術后各種并發(fā)癥發(fā)生較多,有效的臨床藥物也有所欠缺。隨著結(jié)腸癌患者人數(shù)增加,死亡率較高,抗結(jié)腸癌藥物的研發(fā)越來越受到科研工作者的重視。五環(huán)三萜類化合物的抗腫瘤活性已經(jīng)獲得廣泛認可,2α,3α,24-三羥基-12-烯-28-烏蘇酸(TEOA),是從畬族習用抗腫瘤中草藥毛花獼猴桃根中提取出的五環(huán)三萜類化合物。我們課題組的前期研究結(jié)果及相關文獻報道證明了 TEOA具有明顯的抗腫瘤、抗炎、抗病毒作用,但關于其作用機理的研究鮮有報道。自噬性細胞死亡通常被稱為Ⅱ型程序性死亡,通過自噬體與溶酶體結(jié)合形成自噬溶酶體,將包裹的細胞器和蛋白消化、降解、吞噬。探究藥物誘導腫瘤細胞發(fā)生自噬性細胞死亡作用機制,對尋找治療癌癥臨床藥物有重要意義。本研究選取三株不同人源的結(jié)腸癌細胞為研究對象,探究TEOA抗人結(jié)腸癌細胞作用機制,進而為TEOA的新藥開發(fā)及臨床應用提供更深入的理論依據(jù)。1..TEOA對三株人結(jié)腸癌細胞的生長、增殖抑制作用及形態(tài)學觀察本章以三株不同類型不同蛋白表達的人結(jié)腸癌細胞株SW620、SW480、HCT116細胞為研究對象,采用MTT法考察不同藥物濃度、不同作用時間TEOA對人結(jié)腸癌的生長抑制率;利用平板克隆實驗考察TEOA對人結(jié)腸癌SW620、SW480、HCT116細胞增殖能力的影響;運用結(jié)晶紫染色,在光學顯微鏡下觀察TEOA對人結(jié)腸癌細胞形態(tài)學影響。結(jié)果顯示,TEOA對三株人結(jié)腸癌SW620、SW480、HCT116細胞的生長抑制呈劑量依賴性,能夠抑制三株結(jié)腸癌細胞的增殖,誘導三株人結(jié)腸癌細胞系(SW620、SW480、HCT116)產(chǎn)生不同程度的空泡現(xiàn)象。2.TEOA抗人結(jié)腸癌SW620細胞作用機制探討采用流式細胞儀PI/Annexin V-FITC雙染色法測不同TEOA濃度作用后人結(jié)腸癌SW620細胞凋亡率;利用western blot技術檢測凋亡標志性蛋白caspase-9和PARP蛋白表達水平。結(jié)果顯示TEOA能引起人結(jié)腸癌SW620早凋和晚凋,并且凋亡率呈現(xiàn)劑量依賴性;TEOA激活了凋亡標志性蛋白capase-9和PARP蛋白的剪切,并且蛋白表達量隨TEOA劑量的增加而逐漸增加。綜合實驗結(jié)果可以初步說明TEOA能誘導人結(jié)腸癌SW620細胞凋亡。采用MDC染色法檢測不同藥物濃度TEOA作用后,人結(jié)腸癌SW620細胞產(chǎn)生的自噬小體數(shù)量;運用western blot檢測自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ及p62表達量;結(jié)果顯示,藥物處理后人結(jié)腸癌SW620細胞內(nèi)成熟自噬小體的數(shù)量隨TEOA濃度的增高而增加;TEOA明顯促進了自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ及p62蛋白的表達,并具有劑量依賴性。利用MTT、流式細胞儀PI/AnnexinV-FITC雙染色法、western blot考察加入自噬抑制劑3-MA后,人結(jié)腸癌SW620細胞存活率、凋亡率以及凋亡標志蛋白表達水平。結(jié)果顯示,細胞自噬被抑制后,人結(jié)腸癌SW620細胞存活率、凋亡率以及凋亡標志蛋白PARP表達水平都沒有明顯提高。綜合上述實驗結(jié)果,說明TEOA引發(fā)人結(jié)腸癌SW620細胞發(fā)生自噬性死亡。運用western blot技術檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激通路上相關蛋白(PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP)及線粒體自噬相關蛋白(p62、Parkin、PINK1)的表達水平,利用熒光探針DCFH-DA進行細胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測。結(jié)果顯示TEOA能夠使p-PERK、p-eIF2α、CHOP蛋白表達量上調(diào)并且呈現(xiàn)劑量依賴性,PERK、eIF2α蛋白表達量不變;加入自噬抑制劑3-MA后,PERK、p-PERK、eIF2α、p-eIF2α、CHOP蛋白表達量變化不明顯;說明TEOA可劑量性提高p62、Parkin、PINK1蛋白表達水平,自噬抑制后,線粒體自噬相關蛋白表達量變化趨勢不明顯;流式細胞儀結(jié)果顯示TEOA藥物作用后,人結(jié)腸癌SW620細胞內(nèi)ROS升高,伴隨劑量依賴性;根據(jù)上述實驗結(jié)果可以推測TEOA通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激PERK/eIF2α/CHOP通路及ROS介導的線粒體自噬p62/Parkin/PINK1通路誘導人結(jié)腸癌SW620細胞發(fā)生自噬性死亡。3.TEOA抗人結(jié)腸癌SW480細胞作用機制初步探索本部分利用免疫熒光顯微鏡檢測不同藥物濃度TEOA作用后,人結(jié)腸癌SW480細胞內(nèi)被MDC染色的自噬小體的數(shù)量;Western blot檢測自噬標志性蛋白LC3-Ⅱ、p62蛋白表達量變化及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白表達水平。結(jié)果顯示,TEOA濃度越高,人結(jié)腸癌SW480細胞熒光強度越強,自噬小體越多;TEOA能夠提升LC3-Ⅱ、p62蛋白表達水平;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激相關蛋白GRP78、p-PERK和p-eIF2α蛋白表達水平提高,而PERK和eIF2α總蛋白表達量不變;綜合上述實驗結(jié)果可推測TEOA誘導人結(jié)腸癌SW480細胞發(fā)生自噬,TEOA濃度越高,細胞自噬程度越大;TEOA可能是通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激GRP78/PERK/eIF2α/CHOP通路誘發(fā)人結(jié)腸癌SW480細胞自噬死亡。本文通過不同的實驗對TEOA誘導人結(jié)腸癌細胞自噬的作用途徑進行論證,為開發(fā)治療結(jié)腸癌的新藥提供臨床和理論依據(jù)。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

【參考文獻】

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本文編號：1567564