本文選題：前列腺癌　切入點：DU-145細胞　出處：《南方醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景：前列腺癌發(fā)病率在美國占男性腫瘤發(fā)病的第一位,死亡率占男性腫瘤死亡原因的第二位。目前由于中國人口老齡化,前列腺癌的發(fā)病率明顯增加。在我國前列腺癌發(fā)病、死亡分別集中在60-84歲和75-85歲以上癌是雄激素依賴性疾病,因此阻斷雄激素受體信號是前列腺癌治療的標志。許多患者最初從一線內(nèi)分泌去勢治療獲益,而內(nèi)分泌治療最終也只能讓患者有12-48個月的緩解期,緩解期時間長短與腫瘤負荷,宿主因素,腫瘤本身的生物學特性等有關。一旦腫瘤進展,也就是我們臨床上熟知的去勢治療抵抗性前列腺癌(CRPC),這往往是致命的。盡管目前多學科綜合治療手段包括新型二線內(nèi)分泌治療、化療藥物與生物治療等使CRPC的治療效果有所改善,但其適用范圍窄、費用較高等特點使受益患者的數(shù)量有限,總的生存率仍不容樂觀。因此,尋找新靶點的抗癌藥物成為研究熱點。蛋白酶體抑制劑作用于泛素-蛋白酶體通路從而發(fā)揮抗腫瘤作用。蛋白酶體抑制劑增加了促凋亡蛋白水平,降低了抗凋亡蛋白的水平,從而導致細胞周期停滯和細胞凋亡。重要的是,已經(jīng)表明,在多種人類腫瘤細胞中進行測試發(fā)現(xiàn),蛋白酶抑制劑相對于標準細胞毒性劑表現(xiàn)出更有效的細胞凋亡誘導能力。蛋白酶體抑制劑是通過選擇性有效增敏化療/放射治療策略,也是選擇性地以正常組織最小的附帶損傷靶向作用于癌細胞從而克服其耐藥性。因此,這些研究結果提供了令人信服的證據(jù),表明泛素-蛋白酶體靶向途徑與是人類惡性腫瘤的治療中有效的武器。一個新的高度選擇性的,不可逆的環(huán)氧酮類epoxomicin (EPO,環(huán)氧甲酮四肽蛋白酶體抑制劑)類似物-Carfilzomib被開發(fā),與硼替佐米不同,是蛋白酶體抑制活性的新天然化合物,同時還是化療/放射增敏劑,并于2012年FDA批準用于難治多發(fā)性骨髓瘤的治療。它具有鮮明的作用機制,其特點在于具有鮮明的作用機制,其中環(huán)氧酮的官能團和THR1形成了一個獨特的嗎啉環(huán)系統(tǒng)來起到抑制作用,其不可逆地結合至20S蛋白酶體蘇氨酸末端活性部位,從而抑制蛋白酶體的活性。由于沒有其它蛋白酶N-末端的親核殘基能夠作為其活性位點的一部分,這也體現(xiàn)出epoxomicin對蛋白酶體的獨特特異性。與其他的蛋白酶體抑制劑不同的是,此類化合物對蛋白酶體的抑制是特異性的,不抑制蛋白酶體以外的其他蛋白酶,這是由其特殊的抑制機制決定的。比起硼酸類藥物其結合更具有特異性,更具有穩(wěn)定性,且避免了外周神經(jīng)毒性。也正是由于此藥物的特殊性,使其成為新一代蛋白酶體抑制劑,也成為實體瘤治療方面的研究熱點。蛋白酶體抑制劑可通過多種作用機制誘導腫瘤細胞的凋亡,其中可激活頭頸部腫瘤,骨髓瘤細胞等腫瘤細胞的內(nèi)質網(wǎng)應激,然而蛋白酶體抑制劑所致的內(nèi)質網(wǎng)應激機制及與細胞凋亡的關系仍不明確,在前列腺癌中更未見報道。目前引起腫瘤細胞凋亡3條途徑被認可：死亡受體介導的細胞凋亡,也稱外源性凋亡途徑；線粒體依賴的細胞凋亡,也稱內(nèi)源性細胞凋亡以及內(nèi)質網(wǎng)介導的細胞凋亡。內(nèi)質網(wǎng)應激誘導細胞凋亡的過程是復雜的,有內(nèi)質網(wǎng)、線粒體等多個細胞器參與,涉及到多條信號傳導通路。內(nèi)質網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress, ER stress)就是指由于缺氧,熱休克,其他物理或者化學因素導致內(nèi)質網(wǎng)異常蛋白的聚集。通過內(nèi)質網(wǎng)膜受體可以檢測到非折疊蛋白的聚集也就是非折疊蛋白反應(unfolded protein response, URP)。這個復雜的細胞內(nèi)反應是通過內(nèi)質網(wǎng)膜三個受體介導,PERK, ATF6, IRE1。內(nèi)質網(wǎng)應激的初始階段,GRP78從這三個感受器游離,導致大量的游離GRP78產(chǎn)生,表達明顯升高,這也是ER-stress激活的表現(xiàn)。三條UPR反應途徑均可激活CHOP產(chǎn)生,這也是內(nèi)質網(wǎng)應激的中心調節(jié)者,在持續(xù)內(nèi)質網(wǎng)應激存在的狀態(tài)下,它的表達水平也明顯升高。目前研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)質網(wǎng)應激誘導凋亡主要通過三種途徑：CHOP途徑、ASK1(apoptosis signal-regulating kinase l)-JNK(ciun N-terminal kinase)途徑和Caspase-12途徑。因此CHOP途徑是內(nèi)質網(wǎng)應激誘導凋亡的主要途徑之一。基于上述,本課題研究蛋白酶體抑制劑epoxomicin(EPO)對前列腺癌非激素依賴細胞DU-145作用,并研究其與內(nèi)質網(wǎng)應激之間的關系,以及內(nèi)質網(wǎng)應激凋亡蛋白CHOP對細胞凋亡的影響等。從而探討并說明epoxomicin對前列腺癌非激素依賴DU-145細胞的影響及作用機制,為我們臨床治療提供實驗室基礎。目的：1.研究epoxomicin對前列腺癌細胞增殖的作用以及對細胞凋亡的影響。2.通過研究epoxomicin對前列腺癌細胞內(nèi)質網(wǎng)應激分子標記GRP78, CHOP, XBP-ls基因轉錄影響以及對GRP78, CHOP蛋白影響,從而初步探討其作用機制。3.探討4-PBA阻斷劑對epoxomicin誘導細胞內(nèi)質網(wǎng)應激的影響。4.沉默基因CHOP后epoxomicin對前列腺癌細胞生長的影響及對細胞凋亡的影響,從而探討epoxomicin誘導細胞凋亡的機制。方法：1.MTS法檢測及形態(tài)學觀察蛋白酶體抑制劑EPO對前列腺癌DU-145作用：處理組加入不同濃度的EPO(0.8,4,10,20,100nM),并予以不同的處理時間(24,48,72小時)。實驗終點分別用MTS法檢測不同劑量的蛋白酶體抑制劑EPO,作用不同時間對前列腺癌DU-145細胞增殖的影響,對活細胞數(shù)目的影響。通過倒置顯微鏡從形態(tài)學觀察對DU-145細胞的影響。2. Annexin-V/PI檢測對DU-145細胞凋亡的影響：實驗組加入EPO10、20nM,24小時后收集細胞,通過Annexin-V/PI檢測EPO10、20nM作用24小時后DU-145細胞凋亡情況。3.實時熒光定量PCR法檢測CHOP、GRP78、XBP-1及XBP-ls基因變化：EPO10、20nM作用24、48、72小時后檢測CHOP、GRP78、XBP-ls基因的變化情況；EPO20nM作用6、12、24、36小時后XBP-1及XBP-1s基因變化情況。4.Western-blotting法檢測CHOP、GRP78蛋白含量的變化：EPO10、20nM作用24、48、72小時后Western-blotting法檢測CHOP、GRP78蛋白含量的變化。5.4-PBA阻斷劑與EPO對前列腺癌DU-145細胞的影響作用：4-PBA作用1小時后聯(lián)合使用EPO對前列腺癌DU-145細胞對CHOP、GRP78基因轉錄影響；4-PBA作用后1小時后聯(lián)合使用EPO對前列腺癌DU-145細胞生長的影響。6.CHOP基因沉默后EPO對DU-145細胞的影響：CHOPsiRNA沉默基因CHOP后,EPO20nM對DU-145細胞生長、細胞凋亡的影響。7.統(tǒng)計學方法：實驗數(shù)據(jù)均以SPSS17.0統(tǒng)計軟件分析,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x±s)表示。細胞增殖、基因轉錄及蛋白水平與時間關系采用2因素析因分析方差分析；基因轉錄及蛋白水平與對照組之間的比較采用95%的可信區(qū)間；其他用單因素方差分析(One-Way ANOVA),組間數(shù)據(jù)方差齊性時采用Student-Newman-Keuls檢驗,方差不齊時采用近似F檢驗(Welch方法)及多重比較的Dunnett'S T3方法。P0.05認為有統(tǒng)計學意義。結果：1.EPO對前列腺癌DU-145細胞增殖的抑制作用：不同組別活細胞數(shù)目比較差異有統(tǒng)計學意義(F=160.640,P0.001)；不同時間點活細胞數(shù)目比較差異無統(tǒng)計學意義(F=1.335,P=0.267)；時間和組間交互作用有統(tǒng)計學意義(F=22.784,P0.001)；EPO 0.8nM處理組與正常對照組對應時間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)；EPO 4、10 nM第2、3天活性細胞數(shù)量與對照組比較,細胞數(shù)量下降明顯(P0.05)；EPO 20nM及EPO 100nM組活細胞數(shù)目與對照組第1、2、3天均明顯下降,差異有顯著統(tǒng)計學意義(P0.05)。倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)梭形細胞形態(tài)有所變化,成為多邊形或者類圓形,細胞數(shù)目明顯減少。2.對DU-145細胞凋亡的影響：EPO10nM及20nM組凋亡率分別為(25.04±3.21)%、(38.81±4.94)%,與對照組(5.51±0.61)%相比差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),同時也發(fā)現(xiàn)EPO20nM組凋亡率與EPO 10nM組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。3. CHOP、GRP78、XBP-1及XBP-1s基因變化：不同濃度EPO處理后各基因表達差異有統(tǒng)計學意義(CHOP:F=15.669, P0.01; XBP-1s:F=12.724, P 0.01; GRP78:F=31.624, P0.01); EPO處理不同時間各組各基因表達差異有統(tǒng)計學意義(CHOP:F=241.982, P0.001; XBP-1s:F=91.382, P0.001; GRP78:F=101.657,P0.001);EPO處理不同濃度與不同時間CHOP、GRP78基因表達存在交互作用(CHOP:F=9.635,P=0.003;GRP78:F=15.521,P0.001); EPO處理不同濃度與不同時間XBP-1s基因水平無交互作用(F=3.569,P=0.061)。與對照組比較采用95%的可信區(qū)間,CHOP、GRP78及XBP-1smRNA表達在24、48、72h處理組明顯高于對照組。單因素方差分析48h EPOlOnM組與20nM組比較,CHOP、XBP-1smRNA表達差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；48、72 h兩組GRP78mRNA比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。XBP-1及XBP-1s mRNA兩者不同時間差異有統(tǒng)計學意義(F=724.225,P0.001)。同一時間XBP-1及XBP-1s mRNA差異有統(tǒng)計學意義(F=219.593,P0.001),XBP-1及XBP-1s mRNA轉錄水平與時間之間有交互作用(F=202.587,P0.001)。單因素方差分析XBP-1及XBP-1smRNA從6h開始同一時間兩者之間差異均有統(tǒng)計學意義(P0.01)。不同時間兩者與對照組比較采用95%可信區(qū)間,結果顯示6、12、24、36h兩者表達水平明顯高于對照組。4. CHOP、GRP78蛋白含量的變化：不同濃度EPO處理后蛋白水平差異有統(tǒng)計學意義(CHOP:F=46.148,P0.001; GRP78:F=46.148, P0.001);EPO處理不同時間各組差異有統(tǒng)計學意義(CHOP:F=161.677,P0.001;GRP78:F=80.982,P0.001)；EPO處理不同濃度與不同時間CHOP蛋白存在交互作用(F=21.941,P0.05)。EPO處理不同濃度與不同時間GRP78蛋白無交互作用(F=3.594,P=0.060)。單獨效應分析,EPO處理組與對照組比較,采用95%的可信區(qū)間,24、48、72h后EPO處理組CHOP、GRP78蛋白明顯高于對照組；72h EPO 20nM組與10nM組CHOP蛋白比較差異有統(tǒng)計學意義(F=27.475,P=0.003)；24h、72h兩組比較GRP78蛋白差異有統(tǒng)計學意義(24h.F=24.332,P0.05；72h.F=17.824,P0.05)。5.4-PBA阻斷劑與EPO對前列腺癌DU-145細胞的影響作用：與對照組比較采用95%可信區(qū)間,PBA1、3mM單用組CHOP、GRP78mRNA表達與對照組比較,無明顯變化；其他組間比較采用單因素方差分析,PBA1、3mM聯(lián)合EPO20nM組與EPO組比較,表達顯著下降,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。PBAlmM聯(lián)合EPO 20nM活細胞數(shù)目較EPO20nM組增加,但活細胞數(shù)目仍低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)：而PBAlmM聯(lián)合EPO 4nM處理,活細胞數(shù)目與正常組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),活細胞數(shù)目高于EP04nM組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)；PBA3mM聯(lián)合EPO 4、20nM其活細胞數(shù)目與相應EPO組比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),與對照組比較,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。6. CHOP基因沉默后EPO對DU145細胞的影響：與對照組比,沉默基因CHOP后CHOP基因、蛋白水平NS+EPO組及EPO組明顯增加：兩組間比較差異無統(tǒng)計學意義(P0.05)。CHOPsiRNA10及50nM聯(lián)合EPO組,CHOP基因表達、蛋白水平與對照組比較差異無統(tǒng)計學意義；與EPO組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。證實我們基因沉默是成功的。沉默基因CHOP后,CHOPsiRNA10、 50nM+EPO20nM組細胞數(shù)目較EPO20nM組增多,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),50nM組更為明顯,但兩組細胞數(shù)目都仍低于對照組,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05)。CHOP基因沉默后EPO處理DU-145細胞,其凋亡率(21.96±2.31)%,顯著高于正常組,但低于EPO組,差異有統(tǒng)計學意義(P.01)。結論：1.EPO對前列腺癌DU-145細胞具有明顯的抑制作用,呈現(xiàn)濃度時間依賴性；細胞形態(tài)學上進一步說明EPO對DU-145細胞具有殺傷作用；EPO引起前列腺癌DU-145細胞凋亡,隨著EPO濃度增加,凋亡率也增加。2.EPO導致DU-145細胞產(chǎn)生內(nèi)質網(wǎng)應激,其分子標志CHOP、GPR78、XBP-ls轉錄水平明顯升高,隨著時間這三個轉錄基因水平逐漸升高。EPO可導致DU-145細胞XBP-1s明顯升高,且隨著時間變化明顯,而XBP-1變化不明顯。EPO激發(fā)蛋白GRP78、CHOP水平明顯升高,隨著時間逐漸升高,72小時20nM組與10nM組比較,差異有統(tǒng)計學意義。3.4-PBA可阻斷EPO誘導的DU-145細胞內(nèi)質網(wǎng)應激CHOP、GRP78基因轉錄水平的表達：阻斷EPO誘導的DU-145細胞數(shù)目的減少。這兩點也恰恰證明了EPO誘導DU-145產(chǎn)生了內(nèi)質網(wǎng)應激。4. CHOP基因沉默后CHOP基因表達及蛋白水平明顯下降,說明我們所用的方法沉默基因CHOP是成功的；CHOP基因沉默后EPO對DU-145細胞生長抑制部分被阻斷；細胞凋亡也部分被阻斷,說明CHOP是EPO誘導DU-145細胞凋亡的重要基因。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25
，

本文編號：1567282