本文選題：miR-582-5p　切入點：Rab27a　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究目的結(jié)腸癌已成為一種高發(fā)病與高死亡率率癌癥,然其發(fā)生的內(nèi)在分子機制仍不清楚且沒有統(tǒng)一的認(rèn)識。microRNA已經(jīng)被大量報道在調(diào)控結(jié)腸癌細(xì)胞功能的過程中扮演著重要角色,其中的一個重要成員miR-582-5p已被報道在結(jié)腸癌組織中受到抑制,表達處于較低水平,提示其可能參與了結(jié)腸癌的調(diào)控。本文旨在研究miR-582-5p對于介導(dǎo)結(jié)腸癌的作用研究以及探索其內(nèi)在機制。首先,研究miR-582-5p在25例患者的結(jié)腸癌組織以及人結(jié)腸癌細(xì)胞系(SW480、HCT-116、 LoVo、HCT8和SW620)的表達水平,分析miR-582-5p的表達變化對于結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲以及細(xì)胞周期的影響,并研究miR-582-5p對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)控功能。其次,研究miR-582-5p靶向調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子Rab27a對于結(jié)腸癌細(xì)胞系增殖、侵襲以及細(xì)胞周期的影響。最后,檢測miR-582-5p對于Rab27a相關(guān)信號通路的調(diào)控,以此來尋找miR-582-5p靶向調(diào)控Rab27a介導(dǎo)結(jié)腸癌的分子機制。方法1.利用實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測miR-582-5p在結(jié)腸癌組織、癌旁組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞系的表達變化。使用miR-582-5p mimic對進行細(xì)胞進行瞬時轉(zhuǎn)染,使:niR-582-5p過表達。使用Western blot以及細(xì)胞活力檢測實驗(MTT)、細(xì)胞周期分析、凋亡實驗和細(xì)胞侵襲實驗從分子和細(xì)胞水平檢測miR-582-5p對于結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。2.利用生物信息學(xué)和熒光素酶報告實驗篩選并確定miR-582-5p調(diào)控結(jié)腸癌的直接靶基因。3.構(gòu)建Rab27a過表達質(zhì)粒(Rab27a),在過表達miR-582-5p的基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染Rab27a過表達載體。通過qRT-PCR、蛋白免疫印跡、MTT實驗、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡實驗和侵襲實驗驗證miR-582-5p靶向調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子Rab27a對于結(jié)腸癌的調(diào)控效應(yīng)。4.構(gòu)建FAK的siRNA慢病毒表達載體以及使用Integrin抑制劑Cilengitide(CIL),并借助qRT-PCR和蛋白印跡實驗在結(jié)腸癌細(xì)胞中探索miR-582-5p對Rab27a的調(diào)控與integrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的關(guān)系。使用MTT實驗、細(xì)胞周期分析、細(xì)胞凋亡實驗和侵襲實驗探索integrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑對于miR-582-5p通過負(fù)調(diào)控Rab27a介導(dǎo)的結(jié)腸癌細(xì)胞的活力、侵襲、凋亡和細(xì)胞周期的影響。在結(jié)腸癌的臨床組織中檢測Rab27a、Integrin-β1、FAK及p-FAK (Y397)的表達變化。結(jié)果1.人正常組織中,miR-582-5p在結(jié)腸、胃和小腸等胃腸道系統(tǒng),肝臟和脾臟等消化組織中表達較低。進一步的檢測發(fā)現(xiàn),25例結(jié)腸癌患者的組織中有19例組織中的miR-582-5p下調(diào)明顯。并且miR-582-5p在結(jié)直腸癌細(xì)胞系和結(jié)直腸癌組織中表達與正常細(xì)胞對照組相比下調(diào)(HCT8、HCT-116、LoVo、SW480和SW620),而癌旁組織沒有變化。miR-582-5p通過抑制細(xì)胞周期的G1向S期發(fā)展從而的制約結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖：(1)MTT細(xì)胞活性檢測結(jié)果表明過表達miR-582-5p抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖；(2)過表達miR-582-5p的SW480和HCT-116細(xì)胞G1期的細(xì)胞數(shù)顯著增加,但在S期的細(xì)胞數(shù)顯著降低。過表達miR-582-5p增加SW480和HCT-116細(xì)胞的凋亡；(3) Rb/E2F1的Western blot檢測結(jié)果為,Rb在癌細(xì)胞系中表達較低,而E2F1在癌細(xì)胞系中表達較高,過表達：miR-582-5p后,上調(diào)Rb的表達,下調(diào)E2F1的表達。Transwell細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達miR-582-5P抑制了結(jié)腸癌細(xì)胞侵襲能力。結(jié)腸癌細(xì)胞系中PARP-1被過表達miR-582-5p下調(diào),PARP-1 cleaved form被過表達miR-582-5p上調(diào)。并且過表達miR-582-5p可抑制mTOR、Akt、pAk、Erk1/2以及pErk1/2等相關(guān)信號分子的表達。2在結(jié)腸癌細(xì)胞系中,qRT-PCR和Western blot的檢測均表明過表達miR-582-5p顯著抑制Rab27a的表達。在結(jié)腸癌患者結(jié)腸組織的檢測發(fā)現(xiàn),19例miR-582-5p下調(diào)的組織中Rab27a的上調(diào)明顯強于6例miR-582-5p未下調(diào)的患者組織。生物信息學(xué)預(yù)測與熒光素酶報告實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn),在miR-582-5p調(diào)節(jié)結(jié)腸癌的病理過程中Rab27a是其直接的調(diào)控靶基因之一。3成功構(gòu)建Rab27a穩(wěn)定的過表達載體,在過表達miR-582-5p的基礎(chǔ)上,繼續(xù)轉(zhuǎn)染Rab27a過表達載體。MTT實驗、細(xì)胞周期實驗與Transwell細(xì)胞侵襲實驗結(jié)果表明,Rab27a過表達逆轉(zhuǎn)了miR-582-5p對于癌細(xì)胞增殖與侵襲的抑制效應(yīng)。而過表達Rab27a亦逆轉(zhuǎn)過表達miR-582-5p對于E2F1、PARP-1、Erkl/2、p-Erkl/2以及PI3K/Akt途徑相關(guān)蛋白抑制效應(yīng)；過表達miR-582-5p導(dǎo)致Rb和PARP-1 cleaved form的上調(diào)也被Rab27a的過表達逆轉(zhuǎn)。4過表達：miR-582-5p后繼續(xù)過表達Rab27a,檢測Integrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑關(guān)鍵蛋白Integrin-β1、FAK、p-FAK(Y397)以及信號下游的Wnt經(jīng)典通路與Ras/raf/ERK信號通路關(guān)鍵蛋白。結(jié)果發(fā)現(xiàn),過表達Rab27a可逆轉(zhuǎn)miR-582-5p對于Integrin-β1、 FAK、p-FAK (Y397)以及Wnt經(jīng)典通路與Ras/raf/MEK/ERK主要蛋白的抑制效果。使用Integrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的抑制劑Cilengitide (CIL)后,發(fā)現(xiàn)CIL可以下調(diào)Rab27a、BAX、BAK、IGF-Ⅱ、ILK以及cyclin D1并且下調(diào)PI3K/Akt信號通路、Wnt信號通路和Ras/raf/MEK/ERK信號途徑的關(guān)鍵蛋白。成功構(gòu)建integrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中的FAK的siRNA慢病毒表達載體,并感染結(jié)腸癌細(xì)胞系,得到與Cilengitide相似的結(jié)果。另外我們獲得的25例患者組織中有19例miR-582-5p是下調(diào)(miR-582-5p-D)的,而6例組織miR-582-5p并無下調(diào)(miR-582-5p-ND),而對組織進行相關(guān)蛋白檢測結(jié)果顯示,結(jié)腸癌組織中Rab27a、Integrin-β1、FAK以及p-FAK (Y397)的表達有不同程度上調(diào),miR-582-5p-D的組織中Rab27a、 Integrin-β1、FAK、p-FAK (Y397)上調(diào)幅度比miR-582-5p-ND更顯著。結(jié)論在結(jié)腸癌組織和細(xì)胞系中,miR-582-5p表達均下調(diào),而且過表達miR-582-5p能夠通過靶向抑制Rab27a從而抑制結(jié)腸癌細(xì)胞生長細(xì)胞、從S期進入G1期的進程和細(xì)胞侵襲能力。并且FAK介導(dǎo)的Integrin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能是：miR-582-5p靶向Rab27a抑制癌細(xì)胞行為的主要調(diào)控因素。本研究為患者治療結(jié)腸癌等腫瘤疾病提供一種潛在的治療策略。
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【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.35

【參考文獻】

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本文編號：1560460