本文選題：miR-181a　切入點(diǎn)：microRNA　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：子宮內(nèi)膜癌(endometrial carcinoma,EC)是發(fā)生于子宮內(nèi)膜的一組上皮性惡性腫瘤,好發(fā)于圍絕經(jīng)期和絕經(jīng)后婦女,流行病學(xué)調(diào)查顯示肥胖、高血壓、糖尿病、吸煙、惡性腫瘤家族史、不孕等均是子宮內(nèi)膜癌發(fā)病的高危因素,絕經(jīng)后及絕經(jīng)過渡期陰道流血為子宮內(nèi)膜癌最常見的癥狀。子宮內(nèi)膜癌與宮頸癌、卵巢癌合稱女性生殖道三大惡性腫瘤。其發(fā)病率在美國及一些歐洲國家已高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤首位,在我國,其發(fā)病率僅次于宮頸癌,高居女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第二位,約占女性生殖道惡性腫瘤的20%.30%,且近年來其發(fā)病率逐年上升,患者呈年輕化趨勢,其治療仍無突破性進(jìn)展,術(shù)后存活率仍較低,目前其病因及發(fā)病機(jī)制仍未明確。根據(jù)子宮內(nèi)膜癌的臨床和病理特征,Bohkman將子宮內(nèi)膜癌分為Ⅰ型(雌激素依賴型)Ⅱ型(非雌激素依賴型),兩型的高危因素不同。前者的發(fā)生與長期雌激素刺激(內(nèi)源性或外源性)有關(guān),多發(fā)生在子宮內(nèi)膜增生癥(包括單純性增生、復(fù)雜性增生和不典型增生)的基礎(chǔ)上,因無孕激素拮抗,內(nèi)膜持續(xù)增厚繼而發(fā)生癌變,主要的病理類型為子宮內(nèi)膜樣腺癌,ER(雌激素受體)、PR(孕激素受體)常呈陽性表達(dá),這種病理類型占子宮內(nèi)膜癌的大多數(shù),腫瘤分化好,肌層浸潤淺,預(yù)后較好,PTEN基因失活和微衛(wèi)星不穩(wěn)定是常見的分子事件；而目前研究發(fā)現(xiàn),后者的癌變與雌激素刺激無明確聯(lián)系,其發(fā)病早期內(nèi)膜多萎縮,而非增生,主要的病理類型為漿液性乳頭狀腺癌和透明細(xì)胞癌,其ER、PR一般為不表達(dá)或低表達(dá),多見于絕經(jīng)后婦女,腫瘤惡性程度高,分化差,容易有深肌層浸潤,預(yù)后不良。P53基因突變和HER2基因過度表達(dá)為常見的分子事件。為顯著提高子宮內(nèi)膜癌患者的生存質(zhì)量和生存期,早期發(fā)現(xiàn)、早期診斷、及早干預(yù)是其關(guān)鍵,但是,目前為止,本病尚找到合適的早期診斷的特異性標(biāo)志物。隨著分子生物學(xué)及其技術(shù)和生物信息學(xué)的飛速發(fā)展,微小RNA(microRNA, mir-RNA)成為近幾年來的研究熱點(diǎn),它是一類長約20-23 nt的非編碼單鏈小RNA,具有高度保守性、時(shí)序表達(dá)特異性、組織表達(dá)特異性三大特性。通過在轉(zhuǎn)錄后結(jié)合到靶基因mRNA的3'-UTR(3’非編碼區(qū))誘導(dǎo)靶mRNA的降解或抑制靶mRNA的翻譯,或其他形式的調(diào)節(jié)機(jī)制,實(shí)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄后水平的調(diào)控作用,進(jìn)而影響各種生物學(xué)性狀。miRNA在腫瘤發(fā)生和發(fā)展過程中充當(dāng)癌基因或者抑癌基因作用,其表達(dá)的變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、診斷、治療及預(yù)后密切相關(guān)。最近的研究報(bào)道顯示發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)譜的異常與子宮內(nèi)膜癌的臨床特征如分期、子宮肌層浸潤、復(fù)發(fā)、淋巴轉(zhuǎn)移等都存在明顯相關(guān)性。如Yoneyama等人研究發(fā)現(xiàn)在子宮內(nèi)膜腺癌中miR-200a、miR-200b、miR-429表達(dá)明顯上調(diào),可能通過下調(diào)抑癌基因PTEN(第10號(hào)染色體同源丟失性磷酸酶張力蛋白基因)的表達(dá)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生。Lee等研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)miR-200家族的表達(dá)被抑制后,HEC-1A細(xì)胞及Ishikawa細(xì)胞生長均減慢,而且轉(zhuǎn)染了miR-429的HEC-1A細(xì)胞,細(xì)胞對順鉑的耐藥性減弱。Karaayvaz等研究發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜癌中miR-200c和miR-205表達(dá)明顯升高,其中miR-205與子宮內(nèi)膜癌的預(yù)后明顯相關(guān),通過Kaplan-Meier生存分析顯示miR-205表達(dá)水平越高患者總體生存率的越低。結(jié)果提示miR-205通過降低PTEN的表達(dá)導(dǎo)致子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展及不良預(yù)后。miR-181a是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種miRNA,廣泛存在于各種細(xì)胞中,在細(xì)胞的生長、增殖、分化和凋亡的過程發(fā)揮重要的調(diào)控作用。miR-181a的表達(dá)異常與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)、白血病、乳腺癌、消化系統(tǒng)腫瘤、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞瘤、肺癌、口腔鱗狀細(xì)胞癌和宮頸癌、卵巢癌的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。目前,國外研究發(fā)現(xiàn),在新鮮冰凍子宮內(nèi)膜癌組織中,miR-181a的表達(dá)上調(diào),其靶基因可能為PR, PR的表達(dá)與miR-181a的表達(dá)成負(fù)相關(guān)。而國內(nèi)尚未見有關(guān)miR-181a與子宮內(nèi)膜癌分型及臨床特征關(guān)系的研究報(bào)道。本研究團(tuán)隊(duì)前期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)Hsa-miR-181a在甲醛固定石蠟包埋子宮內(nèi)膜癌組織中表達(dá)上調(diào),可能起到癌基因的作用,且Hsa-miR-181a在Ⅱ型內(nèi)膜癌組織中的表達(dá)較Ⅰ型內(nèi)膜癌組織明顯上調(diào)。有大量研究者發(fā)現(xiàn)miRNA表達(dá)譜在Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中存在差異,同時(shí)有不同的靶基因和分子信號(hào)通路,可能參與了Ⅰ型/Ⅱ型內(nèi)膜癌的不同發(fā)病機(jī)制。如周靜等選取了可能以ERa為靶基因的miR-100在細(xì)胞系Ishikawa(來源于Ⅰ型內(nèi)膜癌)和KLE(來源于Ⅱ型內(nèi)膜癌)體外培養(yǎng)細(xì)胞和體內(nèi)成瘤組織以及10例臨床內(nèi)膜癌標(biāo)本中進(jìn)行了qRT-PCR驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)hsa-miR-100在Ⅱ型組的表達(dá)顯著高于Ⅰ型組,其靶基因可能為ERa。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌中miR-143、miR-145明顯下調(diào),與DNMT3B(DNA甲基轉(zhuǎn)移酶)過度表達(dá)相關(guān),而在Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中,miR-143、miR-145表達(dá)與DNMT3B并無明顯相關(guān)性。那么miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)膜癌不同發(fā)病機(jī)制中可能的靶基因或信號(hào)通路是什么?CA125是存在于細(xì)胞表面的一種大分子糖蛋白,廣泛存在于體腔上皮起源的各種組織細(xì)胞中及這些組織細(xì)胞發(fā)生的腫瘤中,如在正常情況下子宮內(nèi)膜、輸卵管及腹膜都能有極其微量CA125生成,在卵巢上皮癌、輸卵管癌、子宮內(nèi)膜癌及間皮細(xì)胞癌等腫瘤中CA125均明顯升高�，F(xiàn)已被廣泛應(yīng)用于泌尿生殖系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等腫瘤的診斷和追蹤。目前在臨床上,CA125已被廣泛應(yīng)用于盆腔包塊(尤其是卵巢上皮性腫瘤)的鑒別診斷、監(jiān)測療效及判斷預(yù)后。目前有關(guān)子宮內(nèi)膜癌CA125的檢測大多局限于血清學(xué)檢測,然而子宮內(nèi)膜癌與血清CA125與的關(guān)系研究及檢測價(jià)值一直存在爭議,有學(xué)者認(rèn)為術(shù)前血清CA125與組織學(xué)類型、病理分期分級(jí)、肌層浸潤及淋巴轉(zhuǎn)移均明顯相關(guān),然而大部分學(xué)者認(rèn)為血清CA125水平并不能準(zhǔn)確地反映腫瘤進(jìn)展程度,與肌層浸潤深度無關(guān),對預(yù)測預(yù)后無幫助�？赡芘c子宮內(nèi)膜癌患者的CA125抗原量不足、進(jìn)入外周血后被迅速清除,或經(jīng)宮腔內(nèi)脫落未進(jìn)入血液循環(huán)有關(guān),致使早期子宮內(nèi)膜癌血清CA125陽性率降低。有研究者發(fā)現(xiàn)將子宮內(nèi)膜癌組織中CA125敏感性和特異性均顯著高于血清CA125,且與子宮內(nèi)膜癌病理分級(jí)有關(guān),病理分期越高,組織中CA125表達(dá)率越高。本團(tuán)隊(duì)早期實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),CA125在子宮內(nèi)膜及其病變組織中的表達(dá)與內(nèi)膜組織的病理演變進(jìn)程一致,病變越嚴(yán)重,腺細(xì)胞生長和分泌越活躍,產(chǎn)生的CA125越多,但是在低分化及惡性程度高的子宮內(nèi)膜癌中CA125表達(dá)有減弱的現(xiàn)象。鑒于Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌在病理特征方面的差異,那么在Ⅱ型內(nèi)膜癌中CA125的表達(dá)是否有減弱現(xiàn)象?Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中CA125的表達(dá)是否存在差異?有研究發(fā)現(xiàn)卵巢癌患者術(shù)前血清CA125與卵巢組織中miR-181a的存在關(guān)聯(lián)性。相關(guān)性分析顯示：卵巢癌患者術(shù)前血清CA125表達(dá)與miR-181a的表達(dá)成正相關(guān),隨著血清CA-125的增高的miR-181a的表達(dá)量逐漸升高。那么Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織中miR-181a與CA125的表達(dá)是否也存在相關(guān)性?若子宮內(nèi)膜病變組織中miR-181a與CA125存在相關(guān)性,其可能的病理機(jī)制或信號(hào)通路是什么?對臨床診斷或預(yù)后判斷是否存在意義?為此,本實(shí)驗(yàn)擬通過檢測甲醛固定石蠟包埋子宮內(nèi)膜組織中miR-181a、CA125在Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)差異,分析miR-181a、CA125在不同類型子宮內(nèi)膜癌中的表達(dá)差異及其兩者的相關(guān)性,探討miR-181a在子宮內(nèi)膜發(fā)生癌變過程中的意義及其可能機(jī)制。第一章 Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中miR-181a的表達(dá)及其意義研究內(nèi)容及方法：1、選擇2011年1月.2013年12月,南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院收治的41例子宮內(nèi)膜癌患者及中山大學(xué)附屬中山醫(yī)院收治的4例、南方醫(yī)科附屬南方醫(yī)院收治的2例Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌患者。為了解子宮內(nèi)膜癌變的發(fā)生發(fā)展過程,同時(shí)選取了南方醫(yī)科大學(xué)附屬小欖醫(yī)院收治的子宮內(nèi)膜增生癥患者18例,正常子宮內(nèi)膜患者13例�；颊吣挲g24-69歲,平均48歲。術(shù)前均未行放化療及內(nèi)分泌治療,術(shù)后診斷均經(jīng)病理證實(shí)。2、子宮內(nèi)膜癌組織均經(jīng)免疫組織化學(xué)染色檢測其中ER、PR表達(dá)：以細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性信號(hào),否則為陰性。根據(jù)組織切片染色結(jié)果分Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌(ER、PR均陽性)和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌(ER、PR均陰性)。3、總RNA提�。好坷灅�(biāo)本連續(xù)切片10張,每張厚10μm,取組織細(xì)胞含量在50%以上區(qū)域的切片每例2-5張(平均4張)制備總RNA。將切片放入1.5mL無水乙醇洗滌2次去除殘余二甲苯。徹底干燥后嚴(yán)格按照QIAGEN總RNA提取試劑盒說明書提取總RNA。4、紫外線分光光度計(jì)檢測提取的總RNA的吸光度(OD值),采用1%瓊脂糖變性凝膠電泳檢測RNA的完整性。5、通過microRNA莖環(huán)引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄,以U6為內(nèi)參,采用SYBR green實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測各組子宮內(nèi)膜組織中miR-181a的表達(dá)。反應(yīng)參數(shù)為95℃預(yù)變性6mmin；95℃變性10s；55℃退火10s；72℃延伸30s,共50個(gè)PCR循環(huán)。記錄Ct值。miRNA相對表達(dá)量即ΔCt=Ct (miR-181a)-CtU6,計(jì)算ΔCt=(Ct(miR-181a)-CtU6)實(shí)驗(yàn)組-(Ct (miR-181a)-CtU6)對照紐,各實(shí)驗(yàn)組miR-181a相對對照組的表達(dá)倍數(shù)以Folds=2-ΔΔCt表示。結(jié)果：1、各組子宮內(nèi)膜組織中miR-181a的表達(dá)：miR-181a在正常子宮內(nèi)膜組織中可見表達(dá),與正常子宮內(nèi)膜組相比,miR-181a在子宮內(nèi)膜癌組織、子宮內(nèi)膜增生癥組織中表達(dá)(△Ct值分別為.3.356±2.401、.1.893±2.568)分別上調(diào)11.228倍(P0.05)、4.073倍(P0.05)。且子宮內(nèi)膜癌組織miR-181a的表達(dá)是子宮內(nèi)膜增生癥組的2.757倍(P0.05)。2、Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織miR-181a的表達(dá)：與正常組相比,Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織中miR-181a的表達(dá)(ACt值分別為-2.957±2.453、.4.832±1.524)分別上調(diào)8.515倍(P0.05)和31.233倍(P0.05)；且Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織中miR-181a表達(dá)是Ⅰ型內(nèi)膜癌組織的3.668倍(P0.05)。與子宮內(nèi)膜增生癥組相比,miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型內(nèi)膜癌組中的表達(dá)分別上調(diào)2.091倍(P0.05,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義)、7.669倍(P0.05)。結(jié)論：從正常子宮內(nèi)膜,到子宮內(nèi)膜增生癥,再到子宮內(nèi)膜癌,miR-181a的表達(dá)呈逐漸上調(diào)的趨勢,miR-181a在子宮內(nèi)膜癌變過程中能參與了子宮內(nèi)膜癌形成的早期分子事件,起到了癌基因的作用,甚至有望成為子宮內(nèi)膜癌的早期篩查及診斷標(biāo)志物。然而在子宮內(nèi)膜增生癥組織中miR-181a的表達(dá)相對Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,相對Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織則顯著降低,Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌組織中miR-181a的表達(dá)明顯高于Ⅰ型,miR-181a的這種差異表達(dá)可能在不同類型內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,尤其與Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病機(jī)制相關(guān)。第二章Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌中CA125的表達(dá)及其與miR-181a的相關(guān)性研究內(nèi)容及方法：將第一部分中子宮內(nèi)膜組織標(biāo)本均經(jīng)過4%甲醛固定,常規(guī)作石蠟包埋切片,厚約4um,采用MaxVisionTM免疫組織化學(xué)染色法檢測組織中CA125表達(dá)。實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按MaxvisionTM檢測試劑盒KIT-5001說明書操作。完全不染色：陰性(.)；CA125陽性染色：在細(xì)胞膜和(或)細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒。弱陽性(+)：染色呈淺棕色,且陽性細(xì)胞率小于10%(觀察10個(gè)高倍視野)；中等陽性(++)：染色介于(+)與(+++)之間,陽性細(xì)胞率10%-50%；強(qiáng)陽性(+++)：CA125染色呈深棕黃色,結(jié)構(gòu)清晰,陽性細(xì)胞率大于50%。結(jié)果：1、正常子宮內(nèi)膜組織中的CA125的表達(dá)以弱陽性為主,子宮內(nèi)膜增生癥和子宮內(nèi)膜癌組織中則以中等陽性及強(qiáng)陽性為主。子宮內(nèi)膜癌中,Ⅰ型內(nèi)膜癌中以強(qiáng)陽性表達(dá)為主,Ⅱ型內(nèi)膜癌中以中等陽性為主。且不同類型子宮內(nèi)膜癌組織中CA125表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=一4.717,P0.05)。2、子宮內(nèi)膜癌變過程中miR-181a與CA125表達(dá)的相關(guān)性：在子宮內(nèi)膜癌變過程中,miR-181a與CA125的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)關(guān)系(P=0.026,r=.0.25)。結(jié)論：子宮內(nèi)膜癌變過程中,CA125與miR-181a的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),這可能與低分化、惡性程度高的子宮內(nèi)膜癌中CA125表達(dá)減弱的現(xiàn)象有關(guān)。全文結(jié)論：miR-181a在Ⅰ型和Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌間的表達(dá)差異可能與不同類型內(nèi)膜癌的發(fā)生、發(fā)展相關(guān)。miR-181a可能參與了子宮內(nèi)膜癌的發(fā)生發(fā)展,尤其是Ⅱ型內(nèi)膜癌,起到了癌基因的作用。其機(jī)制可能是miR-181a通過調(diào)控CA125的表達(dá)而影響子宮內(nèi)膜癌變,但具體作用機(jī)制尚需細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)的驗(yàn)證。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.33

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本文編號(hào)：1560408