發(fā)布時間：2018-03-03 05:36

  本文選題：前列腺癌　切入點：ALKBH　出處：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的近年來我國前列腺癌的發(fā)病率急速上升,已經(jīng)成為泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一。晚期前列腺癌經(jīng)過內(nèi)分泌治療后轉(zhuǎn)化為雄激素非依賴性前列腺癌之后目前尚無有效的方法治療以使患者長期生存,基因治療有可能會成為一種有前景的治療方法。ALKBH是一種DNA損傷修復(fù)蛋白,此前的研究發(fā)現(xiàn)其在前列腺癌中表達水平較高,且與腫瘤細胞的增殖、凋亡及侵襲相關(guān)。本實驗采用RNA沉默技術(shù)通過抑制ALKBH基因的表達,觀察前列腺癌細胞增殖、凋亡及侵襲能力的變化;并統(tǒng)計分析ALKBH基因表達水平與患者預(yù)后之間的關(guān)系。為ALKBH的臨床應(yīng)用及作為基因治療靶點的可行性提供實驗依據(jù)。方法采用半定量RT-PCR和免疫印跡技術(shù)篩選ALKBH表達水平最高的前列腺癌細胞系,利用軟件設(shè)計靶向ALKBH基因mRNA的干擾序列,應(yīng)用BLAST軟件分析各條干擾序列的二級結(jié)構(gòu)及同源性從中篩選3條最佳的干擾片段。人工合成靶向ALKBH的siRNA轉(zhuǎn)錄模板后與質(zhì)粒載體連接,成功構(gòu)建3個RNA沉默重組質(zhì)粒,命名為pSIREN-ALKBH-shRNA-1、2、3。在脂質(zhì)體的介導(dǎo)下將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染給前列腺癌細胞,采用免疫印跡技術(shù)和半定量RT-PCR檢測前列腺癌細胞ALKBH的表達情況,選取沉默效果最佳的重組質(zhì)粒進行后續(xù)實驗,將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌細胞后,采用流式細胞儀和Transwell小室技術(shù)分別檢測前列腺癌細胞的細胞周期的變化,和侵襲能力的變化。同時采用半定量RT-PCR和免疫印跡技術(shù)檢測前列腺癌細胞中c-Myc含量。制備前列腺癌裸鼠移植瘤動物模型,在瘤體局部注射針對ALKBH基因的RNA干擾質(zhì)粒及脂質(zhì)體的混合物,觀察移植瘤的生長情況,采用半定量RT-PCR、免疫印跡技術(shù)和免疫組化檢測瘤組織中ALKBH的表達情況。采用免疫組化法檢測患者前列腺癌和良性前列腺增生組織中ALKBH的表達,分析其表達水平與患者臨床病理特點及預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果采用半定量RT-PCR分別檢測三種RNAi重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染的前列腺癌LNCaP細胞后,結(jié)果示:細胞中ALKBH的mRNA的相對表達量分別為0.412±0.05、0.189±0.01與0.134±0.02,與陰性對照組(1.099±0.12)及空質(zhì)粒組(0.991±0.15)相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),后兩種重組質(zhì)粒的沉默效果更佳,與第一組重組質(zhì)粒比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Western blot檢測陰性對照組、空質(zhì)粒組及pSIREN-ALKBH-shRNA-2、3重組質(zhì)粒組中ALKBH蛋白的相對表達量分別為0.755±0.12、0.812±0.19、0.157±0.07、0.112±0.04。兩種重組質(zhì)粒與陰性對照組及空質(zhì)粒組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),比較之下,第三種重組質(zhì)粒的沉默效果更佳。將pSIREN-ALKBH-shRNA-3重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCaP細胞,48小時后實驗組前列腺癌LNCaP細胞中ALKBH的染色強度、陽性細胞所占比例較對照組明顯減弱,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組與實驗組前列腺癌LNCaP細胞中c-Myc的mRNA的相對表達水平分別為0.103±0.018,0.101±0.012和0.092±0.015。三組前列腺癌LNCaP細胞中c-Myc的表達水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組與實驗組前列腺癌LNCaP細胞中c-Myc蛋白的相對表達水平分別為0.775±0.09、0.796±0.12和0.275±0.05,實驗組前列腺癌LNCa P細胞中c-Myc蛋白的表達水平顯著下降,與陰性對照組和空質(zhì)粒組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。實驗組前列腺癌LNCaP細胞增殖速度明顯低于陰性對照組及空質(zhì)粒組,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。Transwell小室結(jié)果表明轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒后前列腺癌LNCaP細胞穿透小室到達對側(cè)的遷徙細胞數(shù)與對照組相比明顯減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組前列腺癌LNCaP細胞中G0/G1期細胞所占比例分別為為(71.53±1.13)%、(69.78±1.23)%和(31.04±1.01)%,實驗組前列腺癌LNCaP細胞中G0/G1期細胞所占比例最低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。S期細胞所占比例為(19.26±0.88)%、(20.54±0.67)%及(51.23±1.25)%,實驗組前列腺癌LNCaP細胞中S期細胞所占比例最高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組細胞的凋亡率分別為(2.21±1.65)%、(2.27±1.56)%及(6.28±1.56)%,差別有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。將重組干擾質(zhì)粒注射到裸鼠移植瘤的局部,可見實驗組的移植瘤生長速顯著顯減緩,與陰性對照組、空質(zhì)粒組相比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組瘤組織中ALKBH mRNA的相對表達量分別為0.088±0.016,0.112±0.022和0.043±0.005。實驗組瘤組織中ALKBH mRNA的相對表達量顯著較低,與陰性對照組和空質(zhì)粒組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組瘤組織中ALKBH蛋白的相對表達量(ALKBH/GAPDH的灰度值比值)分別為0.884±0.11,0.775±0.18和0.135±0.07。實驗組瘤組織中ALKBH蛋白的相對表達量較低,與陰性對照組和空質(zhì)粒組比較,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。陰性對照組、空質(zhì)粒組和實驗組瘤組織中細胞的ALKBH蛋白陽性表達率分別為82.6%、79.8%和45.1%。實驗組瘤組織中細胞的ALKBH蛋白陽性表達率最高,與其他兩組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。采用Kaplan Meier單因素回歸分析軟件對前列腺癌患者進行統(tǒng)計結(jié)果顯示ALKBH蛋白表達水平與患者預(yù)后密切相關(guān)(P0.05)。結(jié)論本實驗構(gòu)建成功針對ALKBH的重組干擾質(zhì)粒,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染前列腺癌LNCaP細胞后可以檢測到細胞內(nèi)ALKBH的mRNA及蛋白的表達水平均明顯下降,細胞的細胞周期受到阻滯、增殖受到抑制、凋亡增加、侵襲能力下降。應(yīng)用重組質(zhì)粒可以抑制裸鼠移植瘤的生長、且瘤組織中ALKBH的表達顯著降低。ALKBH與患者的總體生存率呈負相關(guān),是影響前列腺癌患者總體生存率的獨立預(yù)后因素,可以作為基因治療前列腺癌的靶點之一,具有臨床應(yīng)用價值。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.25

【參考文獻】

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本文編號：1559766