本文選題：子宮內(nèi)膜癌　切入點：放療　出處：《鄭州大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景近幾十年來,由于子宮內(nèi)膜癌呈現(xiàn)世界性的高發(fā)病率,其死亡人數(shù)高于同期卵巢癌及宮頸癌患者,使得研究界及醫(yī)療界對子宮內(nèi)膜癌的關(guān)注日趨上升,因此如何改善對子宮內(nèi)膜癌患者的治療療效尤顯重要。對于多數(shù)子宮內(nèi)膜癌患者的治療,手術(shù)仍是其主要的治療方式。但對于低分化或無分化型的I型子宮內(nèi)膜樣腺癌,以及Ⅱ型非腺癌類的子宮內(nèi)膜癌患者,治療后的原位復(fù)發(fā)率較高,5年生存率低于50%,稱之為高危型子宮內(nèi)膜癌。對于此類患者,在手術(shù)治療的同時,輔助放療(RT)是其最主要的治療方式。但臨床資料顯示,放療并不能改善高危型子宮內(nèi)膜癌患者的長期生存率。放療在殺傷普通腫瘤細胞的同時,不能有效的殺傷對放療具有耐受性的腫瘤干細胞(CSC),使得學(xué)界對放療提出了諸多質(zhì)疑。腫瘤干細胞具有自我更新及分化的潛能,因此具有高度的成瘤性,在一定條件下,還可與非腫瘤干細胞之間形成雙向性轉(zhuǎn)化,其調(diào)控機制可能與一群細胞轉(zhuǎn)錄因子關(guān)系密切,稱為干細胞轉(zhuǎn)錄因子(STFs)。在子宮內(nèi)膜癌中,體內(nèi)、體外實驗均證實有腫瘤干細胞的存在,其中干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug等可能參與了對子宮內(nèi)膜癌中腫瘤干細胞的調(diào)控及腫瘤的復(fù)發(fā)過程。因此我們在殺傷腫瘤細胞的同時,如何下調(diào)腫瘤干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達,從而靶向性殺傷腫瘤干細胞,將成為有望攻克腫瘤的新方向。乙醛脫氫酶(ALDH)是參與氧化代謝的酶,其中ALDH1在子宮內(nèi)膜癌中具有干細胞特性的腫瘤細胞中表達異常增高,ALDH+已作為標(biāo)志物用于對腫瘤干細胞的檢測,有望成為治療腫瘤干細胞的新靶點。Disulfiram(DSF)是ALDH不可逆的抑制劑,作為戒酒藥已被FDA批準(zhǔn)而廣泛使用多年,具有價格低廉、副反應(yīng)輕,可長期給藥的優(yōu)勢。臨床上DSF用于戒酒可每日口服片劑250 500mg,并能長期服用,尚未觀察到明顯的副反應(yīng)發(fā)生,平均藥物代謝血漿濃度為7.2 27μM。近年發(fā)現(xiàn)DSF能與銅離子(Cu2+)結(jié)合,形成DSF和Cu2+復(fù)合物(DSF/Cu),通過多種途徑抑制腫瘤細胞的生長,促進凋亡。Cu2+在正常組織中表達極少,而在CD133表達陽性(CD133+)的腫瘤干細胞區(qū)域富集最明顯。Cu2+這一區(qū)域分布的差異性,使得DSF/Cu能靶向性殺傷腫瘤干細胞成為可能。但目前對DSF/Cu的抗腫瘤作用機制尚不清楚。本課題組前期研究顯示,DSF/Cu能通過抑制乳腺癌細胞中NF-kB的活性,下調(diào)HER2、MYC等干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達,從而逆轉(zhuǎn)乳腺癌非腫瘤干細胞向腫瘤干細胞的轉(zhuǎn)化。在子宮內(nèi)膜癌中,SOX9、OCT4和HER2等因子與腫瘤干細胞功能的維持關(guān)系密切,并具有NF-kB的結(jié)合位點。因此DSF/Cu是否能通過對NF-kB通路的下調(diào),抑制干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達,實現(xiàn)對子宮內(nèi)膜癌中腫瘤干細胞的治療作用有待研究。本課題選用人類低危型子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞系及人類高危型子宮內(nèi)膜癌AN 3CA細胞系作為研究對象,首先檢測放療對其腫瘤干細胞數(shù)量及功能的影響,接著檢測放療聯(lián)合DSF藥物對以上兩種人類子宮內(nèi)膜癌細胞系及人類子宮內(nèi)膜癌動物模型的治療療效,并對放療聯(lián)合DSF藥物的作用機制進行檢測。目前就放療以及聯(lián)合治療對子宮內(nèi)膜癌中腫瘤干細胞的療效研究,尚未見相關(guān)報道。第一部分放療對子宮內(nèi)膜癌中腫瘤干細胞的影響目的本部分旨在探究放療對人類子宮內(nèi)膜癌細胞系中,腫瘤干細胞數(shù)量及成瘤功能的影響,為放療在臨床中的應(yīng)用提供理論指導(dǎo)。方法1采用流式細胞術(shù),對放療前后人類高危型子宮內(nèi)膜癌患者來源的AN 3CA和低危型子宮內(nèi)膜癌患者來源的Ishikawa細胞系中ALDH+、CD133+的細胞數(shù)量進行檢測。2采用體外微球形成實驗,對放療前后AN 3CA和Ishikawa細胞系的體外微球形成數(shù)進行檢測,并計算放療組的微球形成抑制率。采用體內(nèi)成瘤性實驗,將放療前和放療后AN 3CA和Ishikawa細胞系分別種植于nude品系裸鼠體內(nèi),就腫瘤的成瘤率及腫瘤體積進行檢測。3采用克隆形成實驗,對未放療組和放療組中AN 3CA和Ishikawa細胞系的克隆形成抑制率進行檢測。4統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,兩組均數(shù)比較時,若方差齊時采用兩獨立樣本t檢驗,方差不齊時采用Cochran近似t檢驗,以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。結(jié)果1比較放療前后AN 3CA和Ishikawa細胞系中腫瘤干細胞數(shù)量的變化在AN 3CA細胞系中,放療組ALDH+、CD133+細胞的平均百分比與未放療組相比可見明顯增高,放療組為(2.0±0.14)%、(1.9±0.00)%,未放療組為(0.95±0.07)%、(1.45±0.21)%,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。但在Ishikawa細胞系中,放療組ALDH+、CD133+細胞的平均百分比與未放療組相比未見明顯增高(P0.05)。2比較放療前后AN 3CA和Ishikawa細胞系成瘤性的變化在AN 3CA細胞系中,放療組腫瘤干細胞體外成瘤性與未放療組相比未見明顯降低(P0.05)。相對于未放療組,放療組的微球形成抑制率為11.81%。而在Ishikawa細胞系中,與未放療組相比,放療組能顯著性降低腫瘤干細胞的體外成瘤性,放療組微球形成數(shù)為(32.25±3.59)個,未放療組為(56.50±3.13)個,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。相對于未放療組,放療組的微球形成抑制率為43.18%。放療后AN 3CA細胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤率為83.3%(5/6),與未放療組相同;放療組腫瘤平均體積高于未放療組,放療組為(667.70±90.92)mm3,未放療組為(549.97±40.28)mm3,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。3放療組對子宮內(nèi)膜癌中腫瘤干細胞的殺傷特異性:在Ishikawa細胞系中,放療組對微球形成的抑制率(反應(yīng)對腫瘤干細胞的殺傷性)與對克隆形成的抑制率(反應(yīng)對腫瘤細胞的殺傷性)相似,為43.18%和36.33%,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。但AN 3CA細胞系中,放療組對微球形成的抑制率明顯低于對克隆形成的抑制率(P0.05)。結(jié)論放療能非特異性的殺傷人類Ⅰ型子宮內(nèi)膜癌Ishikawa細胞系中的腫瘤干細胞,但不能有效的殺傷人類Ⅱ型子宮內(nèi)膜癌AN 3CA細胞系中的腫瘤干細胞。第二部分放療聯(lián)合DSF對子宮內(nèi)膜癌及其腫瘤干細胞的影響目的本部分研究應(yīng)用放療聯(lián)合DSF藥物,探討聯(lián)合治療對人類子宮內(nèi)膜癌細胞系和人類子宮內(nèi)膜癌動物模型中腫瘤細胞及其中的腫瘤干細胞的殺傷性,為臨床用藥的有效性及安全性提供理論依據(jù)。方法1采用MTT法檢測,對未治療組、DMSO組(DMSO為溶劑對照)、DSF組和DSF/Cu組中,AN 3CA和Ishikawa細胞的生長抑制率進行檢測。2采用流式細胞術(shù),對未放療組、放療+DMSO組、放療+DSF組和放療+DSF/Cu組中,AN 3CA和Ishikawa細胞系的ALDH+、CD133+細胞數(shù)量進行檢測。3采用體外微球形成實驗,對放療+DMSO組和放療+DSF/Cu聯(lián)合治療組中AN3CA和Ishikawa細胞系體外微球形成數(shù)進行檢測,并計算微球形成抑制率。采用體內(nèi)成瘤性實驗,將放療+DMSO和放療+DSF/Cu治療后的AN 3CA細胞系分別種植于nude品系裸鼠右后大腿外側(cè),就腫瘤的成瘤率及腫瘤體積進行檢測。4采用克隆形成試驗,對未放療組、放療+DMSO組和放療+DSF/Cu組中AN3CA和Ishikawa細胞系的克隆形成抑制率進行檢測。5采用蛋白印跡實驗(WB),對放療+DMSO組和放療+DSF/Cu聯(lián)合治療組中AN 3CA和Ishikawa細胞系的促凋亡蛋白Cleaved-PARP和PARP的表達水平進行檢測。6選用AN3CA細胞系,建立人類子宮內(nèi)膜癌動物模型,對未治療組、放療組、放療+DSF組和放療+DSF/Cu組治療后的腫瘤體積、腫瘤重量、裸鼠體重、腫瘤復(fù)發(fā)、裸鼠生存率以及腫瘤組織的體外微球形成數(shù)的變化進行檢測。7統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,兩組均數(shù)比較時,若方差齊時采用兩獨立樣本t檢驗,方差不齊時采用Cochran近似t檢驗,細胞的微球形成抑制率與克隆形成率的比較采用χ2檢驗的Fisher精確概率法,以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。結(jié)果1比較DSF和DSF/Cu對AN 3CA和Ishikawa細胞的生長抑制率在AN 3CA和Ishikawa細胞系中,與DSF組相比,DSF/Cu組能明顯降低細胞的生長抑制率,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2比較放療聯(lián)合DSF/Cu或DSF組和放療組對AN 3CA和Ishikawa細胞系中腫瘤干細胞數(shù)量及成瘤性的影響:在AN 3CA和Ishikawa細胞系中,放療+DSF/Cu組ALDH+、CD133+細胞的平均百分數(shù)與放療+DMSO組相比可見明顯降低,差異均有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。但放療+DSF組ALDH+、CD133+細胞的平均百分數(shù)與放療+DMSO組相比未見明顯降低。放療+DSF/Cu組Ishikawa、AN 3CA細胞系體外成瘤性與放療+DMSO組相比,可見明顯降低,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。AN 3CA細胞系經(jīng)放療+DSF/Cu聯(lián)合治療后,在裸鼠體內(nèi)的成瘤率為50%(n=3/6,)明顯低于放療+DMSO組83%(n=5/6);放療+DSF/Cu聯(lián)合治療的腫瘤平均體積亦小于放療+DMSO組,聯(lián)合治療組為(152.49±40.96)mm3,放療組為(557.78±64.12)mm3,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3放療聯(lián)合DSF/Cu組對子宮內(nèi)膜癌干細胞的殺傷特異性:在AN 3CA細胞中,放療+DSF/Cu聯(lián)合治療組對細胞微球形成的抑制率(反應(yīng)對腫瘤干細胞的殺傷性)明顯高于對克隆形成的抑制率(反應(yīng)對腫瘤細胞的殺傷性),分別為88.89%和66.15%,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。在Ishikawa細胞中,放療+DSF/Cu聯(lián)合治療組對細胞微球形成的抑制率明顯高于對克隆形成的抑制率,分別為98.18%和68.89%,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。4比較放療聯(lián)合DSF/Cu組及放療組對AN 3CA和Ishikawa細胞系凋亡的影響:放療+DSF/Cu聯(lián)合治療組AN 3CA、Ishikawa細胞系中Cleaved-PARP的蛋白表達水平與放療組相比可見明顯升高,聯(lián)合治療組凝膠灰度比值為1.64±0.09、0.91±1.01,放療組為0.91±1.01、0.29±0.20,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5各治療組對人類子宮內(nèi)膜癌動物模型的腫瘤大小、裸鼠體重、腫瘤復(fù)發(fā)率、裸鼠生存率及體外成瘤性影響的比較:放聯(lián)合DSF/Cu組的腫瘤平均體積、重量與放療組相比,未見明顯減小(P0.05);但腫瘤組織平均體外微球形成數(shù),放療聯(lián)合DSF/Cu組與放療組相比,可見明顯降低,放療聯(lián)合DSF/Cu組為(19.33±3.79)個,放療組為(44.00±12.49)個,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。放療聯(lián)合DSF組移植瘤平均體積、重量與放療組相比,可見明顯減小,裸鼠體重與放療組相比可見明顯增加,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);放療聯(lián)合DSF組腫瘤復(fù)發(fā)率最低,裸鼠生存率最高;腫瘤組織平均體外微球形成數(shù),放療聯(lián)合DSF組與放療組相比可見明顯降低,為(3.33±1.53)個和(44.00±12.49)個,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。結(jié)論1.體外實驗證實,放療聯(lián)合DSF/Cu能靶向性殺傷人類子宮內(nèi)膜癌AN 3CA和Ishikawa細胞系中的腫瘤干細胞,同時促進癌細胞的凋亡。2.體內(nèi)實驗證實,放療聯(lián)合DSF可認為是一種治療子宮內(nèi)膜癌安全、有效的治療方式。性的機制研究第三部分放療聯(lián)合DSF對子宮內(nèi)膜癌中腫瘤干細胞殺傷目的首先探究放療是否能上調(diào)AN 3CA和Ishikawa細胞系中干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug的表達水平,進一步檢測放療聯(lián)合DSF/Cu是否能通過下調(diào)NF-kB通路,從而降低由于放療后升高的干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達。方法1采用實時熒光定量PCR法,檢測放療前后,AN 3CA和Ishikawa細胞系中,SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug因子m RNA水平的表達,篩選出經(jīng)放療后增高的干細胞轉(zhuǎn)錄因子。3進一步通過實時熒光定量PCR法和蛋白印跡實驗,比較未放療組、放療+DMSO組、放療+DSF/Cu組對放療后增高的干細胞轉(zhuǎn)錄因子表達水平的影響。4將攜帶NF-kB啟動子的質(zhì)粒p GL4.32[luc2P/NF-kB-RE/Hygro]和內(nèi)參照質(zhì)粒p RL-SV40同時轉(zhuǎn)染子宮內(nèi)膜癌AN 3CA和Ishikawa細胞系,構(gòu)建瞬時轉(zhuǎn)染細胞模型,采用雙熒光素酶報告基因?qū)嶒?檢測未放療組、放療+DMSO組和放療+DSF/Cu組中NF-kB的活性熒光強度比值,采用放療+NF-kB抑制劑(IMD-0354)組為陽性對照。5應(yīng)用放療聯(lián)合NF-kB抑制劑,下調(diào)AN 3CA和Ishikawa細胞系中NF-kB通路的活性,通過實時熒光定量PCR法和蛋白印跡實驗,比較放療+DSF/Cu組和放療+NF-kB抑制劑組中干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達水平。6統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS19.0統(tǒng)計分析軟件進行數(shù)據(jù)處理,兩組均數(shù)比較時,若方差齊時采用兩獨立樣本t檢驗,方差不齊時采用Cochran近似t檢驗,以α=0.05作為檢驗水準(zhǔn)。結(jié)果1放療前后AN 3CA和Ishikawa細胞系中干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX9、Nanog、HER2、OCT4和Slug的表達水平:放療后AN 3CA細胞中SOX9、OCT4和Slug因子的m RNA及蛋白表達水平與未放療組相比可見明顯升高,放療組平均凝膠灰度比值分別為1.26±0.06、12.64±0.15、1.33±0.05,未放療組為0.36±0.16、1.12±0.12、0.53±0.11,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但Ishikawa細胞中未檢測到放療后升高的干細胞轉(zhuǎn)錄因子的表達。2對比放療+DSF/Cu聯(lián)合治療(聯(lián)合治療)和放療+DMSO治療(放療)后對子宮內(nèi)膜癌細胞系中NF-kB/干細胞轉(zhuǎn)錄因子通路的影響2.1聯(lián)合治療以及放療組對AN 3CA和Ishikawa細胞系中NF-kB活性影響的比較:聯(lián)合治療組中AN 3CA和Ishikawa細胞系的NF-kB活性與放療組相比可見明顯降低,聯(lián)合治療組熒光強度比值分別為0.36±0.04和0.40±0.01,放療組為1.23±0.03和1.05±0.02,差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2.2聯(lián)合治療以及放療組對AN 3CA和Ishikawa細胞系中SOX9、OCT4、Slug因子m RNA和蛋白水平的影響:在AN 3CA和Ishikawa細胞中,聯(lián)合治療后SOX9、OCT4和Slug因子的m RNA和蛋白表達水平與放療組相比均可見明顯降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2.3 NF-kB的下調(diào)對AN 3CA和Ishikawa細胞系中SOX9、OCT4、Slug因子m RNA及蛋白水平的影響:在AN 3CA和Ishikawa細胞中,放療聯(lián)合NF-kBi組能顯著性降低SOX9、OCT4因子的m RNA和蛋白表達水平,與放療組相比,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但放療聯(lián)合NF-kBi組不能降低Slug因子的m RNA和蛋白表達水平,與放療組相比,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.放療能上調(diào)AN 3CA細胞系中干細胞轉(zhuǎn)錄因子SOX9、OCT4和Slug的表達。2.放療聯(lián)合DSF/Cu能下調(diào)子宮內(nèi)膜癌AN 3CA和Ishikawa細胞系中NF-kB/SOX9、OCT4通路及非NF-kB/Slug通路的活性。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R737.33

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本文編號：1556713