本文關(guān)鍵詞： A549 Prdx4 細(xì)胞增殖 凋亡 遷移　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：肺癌是臨床常見(jiàn)的惡性腫瘤,并且是癌癥相關(guān)死亡的主要原因。大約85%的肺癌屬于非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC),其主要的病理類型是腺癌和鱗癌。盡管目前對(duì)肺癌的早期發(fā)現(xiàn)和聯(lián)合治療已取得很大進(jìn)步,但患者的整體生存率并沒(méi)有顯著的提高。因此,探索治療肺癌的新方法至關(guān)重要。與其他組織器官相比,肺暴露于更高濃度的氧環(huán)境中,因此它是研究自由基作用的獨(dú)特器官。肺臟通過(guò)一個(gè)廣泛、復(fù)雜而有效的抗氧化防御系統(tǒng),使其免于自由基和活性氧(reactive oxygen species,ROS)的損害。越來(lái)越多的研究表明,過(guò)氧化物還原酶4(peroxiredoxin4,Prdx4)與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。如Prdx4在前列腺癌組織中高表達(dá)并影響前列腺癌細(xì)胞的增殖,抑制Prdx4的表達(dá)可有效促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的凋亡并抑制腫瘤的生長(zhǎng)。此外,Prdx4作為一個(gè)新型分泌型介質(zhì)參與了腫瘤誘發(fā)的破骨細(xì)胞生成。在肺癌中,Prdx4在癌組織的表達(dá)水平明顯高于未癌變組織,這一現(xiàn)象在肺腺癌中尤為明顯。有研究證實(shí),過(guò)表達(dá)Prdx4能夠增強(qiáng)肺腺癌細(xì)胞的侵襲能力,并能促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。為了深入了解Prdx4在肺腺癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)的意義,本研究對(duì)Prdx4在調(diào)節(jié)人肺腺癌A549細(xì)胞增殖、凋亡和遷移過(guò)程中可能的作用進(jìn)行了探索。為此,我們展開(kāi)了以下實(shí)驗(yàn):首先,采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染法將重組質(zhì)粒pcDNA3.0-HA-Prdx4或針對(duì)人Prdx4基因的小干擾RNA(Prdx4 small interference RNA,Prdx4-siRNA)分別轉(zhuǎn)入到人肺腺癌A549細(xì)胞中,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,RT-PCR)和蛋白質(zhì)印跡法(western blot,WB)分別檢測(cè)Prdx4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,pcDNA3.0-HA-Prdx4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組A549細(xì)胞的Prdx4 mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯上調(diào)(P值均0.05),而Prdx4-siRNA干擾組A549細(xì)胞的Prdx4mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)水平明顯下調(diào)(P值均0.01)。隨后,采用細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒(cell counting kit-8,CCK-8)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞的增殖活性。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示,Prdx4過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞在24、48和72h時(shí)的D450nm值均明顯高于pcDNA3.0-HA陰性對(duì)照組(P值均0.05),并且以96h時(shí)的D450nm值2.241±0.068和1.596±0.103,差異更加明顯(P0.01);沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞在48、72和96h時(shí)的D 450nm值明顯低于陰性對(duì)照siRNA(negative control siRNA,NC-siRNA)組(P值均0.01)。接著,采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞的凋亡情況。免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示,Prdx4過(guò)表達(dá)的A549細(xì)胞在順鉑(20μmol/L)刺激24和48h后,凋亡細(xì)胞數(shù)與pcDNA3.0-HA陰性對(duì)照組相比明顯減少,差異均具有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05和P0.01);沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞在順鉑(20μmol/L)刺激24和48h后,凋亡細(xì)胞數(shù)均明顯多于NC-siRNA組(P0.05和P0.01)。最后,一方面,采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞的橫向遷移能力。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Prdx4過(guò)表達(dá)A549細(xì)胞的愈合率明顯高于pcDNA3.0-HA陰性對(duì)照組(P0.01);沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞的愈合率明顯低于NC-siRNA組(P0.01)。另一方面,采用Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)過(guò)表達(dá)或沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞的縱向遷移能力。Transwell遷移實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,Prdx4過(guò)表達(dá)A549細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯高于pcDNA3.0-HA陰性對(duì)照組(P0.01);沉默Prdx4表達(dá)后A549細(xì)胞穿過(guò)小室膜的細(xì)胞數(shù)明顯低于NC-siRNA組(P0.01)。通過(guò)上述研究,可以得出以下的結(jié)論:1、重組質(zhì)粒pcDNA3.0-HA-Prdx4或針對(duì)人Prdx4基因的siRNA成功轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞。2、過(guò)表達(dá)Prdx4促進(jìn)A549細(xì)胞的增殖,沉默Prdx4表達(dá)抑制A549細(xì)胞的增殖。3、過(guò)表達(dá)Prdx4抑制A549細(xì)胞的凋亡,沉默Prdx4表達(dá)促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡。4、過(guò)表達(dá)Prdx4增強(qiáng)A549細(xì)胞的遷移能力,沉默Prdx4表達(dá)減弱A549細(xì)胞的遷移能力。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2
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本文編號(hào)：1556248