本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞癌 干擾素 SLFN5 Stat3 p53　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分SLFN5在人肝癌組織中的表達(dá)情況及其臨床意義目的:Schlafen(Slfn)基因家族作為干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)亞群,參與干擾素抗病毒、抗腫瘤、調(diào)節(jié)免疫等生物學(xué)功能。近年,人們逐漸認(rèn)識(shí)到SLFN5在抑制干擾素治療敏感的惡性黑色素瘤、腎細(xì)胞癌的生長(zhǎng)及侵襲方面發(fā)揮的作用。而SLFN5在肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)中的表達(dá)情況,及其與HCC相關(guān)臨床指標(biāo)之間的關(guān)系尚不清楚,因此我們擬通過(guò)本研究對(duì)SLFN5在HCC樣本中的表達(dá)情況及其臨床意義進(jìn)行評(píng)價(jià)。方法:通過(guò)Real-time PCR,免疫組織化學(xué)和western-blot等技術(shù)檢測(cè)SLFN5基因及蛋白在HCC患者肝癌組織及配對(duì)癌旁組織中的表達(dá)情況,分析90例HCC組織芯片SLFN5蛋白的表達(dá)水平與臨床指標(biāo)之間的關(guān)聯(lián)性,進(jìn)行Kaplan-Meier生存分析并對(duì)危險(xiǎn)因素進(jìn)行Cox風(fēng)險(xiǎn)回歸,評(píng)判SLFN5與HCC預(yù)后的關(guān)系。結(jié)果:肝細(xì)胞癌組織中SLFN5的表達(dá)量顯著低于相應(yīng)癌旁非癌組織�？紤]到每例患者肝癌組織相對(duì)癌旁肝組織SLFN5表達(dá)變化的程度不同。為了反應(yīng)這種內(nèi)在的差異,我們構(gòu)建了一個(gè)新的變量ΔSLFN5(Δslfn5=配對(duì)的癌旁肝組織slfn5蛋白表達(dá)量-肝細(xì)胞肝癌組織slfn5蛋白表達(dá)量)分析其與臨床各相關(guān)指標(biāo)之間的關(guān)系。結(jié)果顯示,Δslfn5與hcc的惡性生物學(xué)行為有關(guān),即隨病理分級(jí)增加,腫瘤tnm分期增加,腫瘤直徑增大,肝癌組織中slfn5下降程度增大(Δslfn5增高),(相應(yīng)的p=0.003;p=0.014;p=0.017)。cox風(fēng)險(xiǎn)比例模型進(jìn)行回歸分析,統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示Δslfn5≥150(p=0.031;hr:4.101;95%ci:1.135 14.815)可能是肝細(xì)胞癌患者術(shù)后生存期的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。結(jié)論:肝癌組織的slfn5表達(dá)均顯著低于癌旁組織,肝癌組織中slfn5下降越多,對(duì)應(yīng)越高的病理分級(jí),更高的tnm分期和較大的腫瘤直徑。kaplan-meier生存分析表明,Δslfn5≥100或150預(yù)示較差的術(shù)后生存期。cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型結(jié)果顯示,Δslfn5≥150是臨床不良預(yù)后的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(p=0.031;hr:4.101)。第二部分:slfn5對(duì)體外培養(yǎng)人肝癌細(xì)胞增殖抑制作用及其機(jī)制研究目的:在第一部分研究中我們發(fā)現(xiàn)slfn5在人hcc組織中表達(dá)降低,且slfn5表達(dá)降低的程度與hcc惡性生物學(xué)行為(更高的病理分級(jí)、更高的tnm分期及更大的腫瘤直徑)及不良預(yù)后有關(guān)。本部分主要在體外細(xì)胞模型上,觀察slfn5表達(dá)變化對(duì)hcc細(xì)胞生長(zhǎng)的影響并探討其可能的機(jī)制。方法:首先進(jìn)一步對(duì)slfn5在體外肝癌細(xì)胞系及正常肝細(xì)胞系中的表達(dá)差異進(jìn)行驗(yàn)證,然后通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)和慢病毒載體感染方法,分別下調(diào)及上調(diào)slfn5蛋白在hcc細(xì)胞的表達(dá),采用cck8法檢測(cè)細(xì)胞增殖、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期、凋亡等實(shí)驗(yàn)方法觀察轉(zhuǎn)染slfn5-siran及感染重組慢病毒lv5-slfn5前后細(xì)胞增殖、周期、凋亡等相關(guān)細(xì)胞生物學(xué)行為的變化。從正反兩個(gè)方面說(shuō)明slfn5蛋白對(duì)hcc細(xì)胞生長(zhǎng)的可能影響。結(jié)果:slfn5mrna及蛋白水平的表達(dá)在正常人肝細(xì)胞l02中均明顯高于smmc-7721、huh-7、hepg2及bel7402等hcc細(xì)胞,細(xì)胞免疫熒光顯示slfn5在肝癌細(xì)胞中的表達(dá)定位以細(xì)胞核為主。進(jìn)一步在smmc-7721及huh-7細(xì)胞干擾或過(guò)表達(dá)slfn5基因后發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組相比,干擾slfn5促進(jìn)了smmc-7721細(xì)胞的增殖,而slfn5過(guò)表達(dá)后顯著地抑制了smmc-7721的增殖;但無(wú)論下調(diào)還是上調(diào)slfn5的表達(dá),對(duì)huh-7細(xì)胞增殖無(wú)明顯的影響。干擾slfn5導(dǎo)致smmc-7721細(xì)胞周期進(jìn)程加快,g1期比率減少,s期及g2/m期增加,增殖指數(shù)s+g2/m明顯增加。過(guò)表達(dá)slfn5導(dǎo)致smmc-7721細(xì)胞s期比率增高,而g2/m細(xì)胞比率減少,發(fā)生細(xì)胞周期s期阻滯。干擾或者過(guò)表達(dá)slfn5對(duì)huh-7的細(xì)胞周期進(jìn)程無(wú)影響;干擾或者過(guò)表達(dá)slfn5對(duì)smmc-7721及huh-7細(xì)胞凋亡無(wú)明顯影響。wb檢測(cè)結(jié)果顯示,在smmc-7721細(xì)胞,干擾slfn5基因,可能通過(guò)上調(diào)cyclind1、cycline、cyclina和激活型cdk2(thr160)等相關(guān)細(xì)胞周期蛋白及周期蛋白依賴性蛋白激酶促進(jìn)周期進(jìn)程。過(guò)表達(dá)slfn5則導(dǎo)致周期蛋白及周期蛋白依賴性激酶相反的變化趨勢(shì),進(jìn)而導(dǎo)致周期阻滯。結(jié)論:與人肝癌組織ihc檢測(cè)結(jié)果一致,slfn5在正常人肝細(xì)胞中表達(dá)明顯高于hcc細(xì)胞。slfn5在肝癌細(xì)胞主要表達(dá)于肝細(xì)胞核。下調(diào)slfn5的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程,促進(jìn)細(xì)胞增殖。而上調(diào)slfn5表達(dá)則通過(guò)抑制細(xì)胞周期蛋白及相應(yīng)的周期蛋白依賴性激酶的表達(dá),促使hcc發(fā)生細(xì)胞周期s期阻滯,從而抑制細(xì)胞增殖。huh-7細(xì)胞增殖、周期、凋亡均不受slfn5表達(dá)改變影響。第三部分:slfn5基因與Ⅰ型ifnα相關(guān)信號(hào)通路關(guān)系初探目的:既往學(xué)者研究小鼠slfn2基因時(shí)發(fā)現(xiàn),ifnα誘導(dǎo)slfn基因家族成員的表達(dá)不同程度依賴于stat1、stat3以及p38信號(hào)分子。但其中slfn5的誘導(dǎo)表達(dá)不僅不依賴于stat3分子,反而在stat3-/-敲除的小鼠胚胎成纖維細(xì)胞(mef)上ifnα誘導(dǎo)slfn5較stat3野生型mef細(xì)胞成倍增加。提示slfn5與stat3分子之間可能存在某種相互調(diào)控機(jī)制,而鼠的slfn5與人的slfn5是一對(duì)直系同源基因,因此,在本部分研究中我們首先證實(shí)ifnα是否也能誘導(dǎo)hcc細(xì)胞slfn5的表達(dá);其次擬對(duì)slfn5與ifnα下游信號(hào)通路jak-stat、pi3k/akt中的關(guān)鍵信號(hào)分子stat3及akt之間可能存在的調(diào)控關(guān)系進(jìn)行研究,以期對(duì)slfn5在hcc中的抗增殖作用的機(jī)制有更深入的理解。方法:本部分通過(guò)real-timepcr、免疫印跡、細(xì)胞共轉(zhuǎn)染技術(shù)與雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)技術(shù)分析干擾素刺激hcc細(xì)胞slfn5mrna及蛋白表達(dá)情況;slfn5表達(dá)改變對(duì)hcc細(xì)胞stat3、akt信號(hào)分子表達(dá)的影響以及對(duì)stat3轉(zhuǎn)錄活性的影響;并對(duì)調(diào)控stat3組成性激活的上游分子p53表達(dá)情況進(jìn)行檢測(cè),以探討slfn5影響stat3轉(zhuǎn)錄調(diào)控的可能機(jī)制。結(jié)果:ifnα刺激可誘導(dǎo)除bel-7402以外的hcc細(xì)胞和l02細(xì)胞slfn5mrna及蛋白的表達(dá)。同時(shí)發(fā)現(xiàn),hepg2與smmc-7721中p-stat3、slfn5的基線表達(dá)情況與我們推測(cè)的相符,二者之間似乎存在負(fù)向調(diào)節(jié)關(guān)系,即hepg2中p-stat3表達(dá)高于smmc-7721,slfn5則低于smmc-7721。進(jìn)一步在smmc-7721細(xì)胞上干擾slfn5,結(jié)果再次印證我們的假設(shè),slfn5表達(dá)下調(diào)導(dǎo)致了p-stat3表達(dá)增加;反之,slfn5過(guò)表達(dá)則抑制了p-stat3的表達(dá)。二者對(duì)t-stat3的表達(dá)均無(wú)影響。對(duì)hcc細(xì)胞共轉(zhuǎn)染相應(yīng)的slfn5-sirna或pcmv6-slfn5-gfp及stat3的sie熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒后stat3轉(zhuǎn)錄活性變化進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí),slfn5可以負(fù)調(diào)控stat3的轉(zhuǎn)錄活性。我們發(fā)現(xiàn)slfn5可以正向調(diào)節(jié)p53野生型細(xì)胞smmc-7721的p53蛋白及其下游靶基因p21的表達(dá);而slfn5對(duì)p53突變型細(xì)胞huh-7的p53蛋白及其下游靶基因p21無(wú)明顯調(diào)控作用。slfn5還可以抑制pi3k-akt信號(hào)通路中akt信號(hào)分子磷酸化。結(jié)論:ifnα可明顯誘導(dǎo)正常人肝細(xì)胞及hcc細(xì)胞slfn5mrna及蛋白的表達(dá);slfn5可以負(fù)調(diào)控stat3的705位點(diǎn)酪氨酸殘基磷酸化,進(jìn)而負(fù)調(diào)控stat3的轉(zhuǎn)錄活性,并負(fù)調(diào)控stat3下游靶基因cyclind1,抑制hcc細(xì)胞增殖。slfn5上調(diào)或下調(diào)可以影響p53野生型smmc-7721細(xì)胞的p53及下游蛋白p21的表達(dá),而不能影響p53突變的Huh-7細(xì)胞,提示SLFN5對(duì)Stat3的磷酸化調(diào)控作用有可能是野生型p53依賴的。SLFN5也可以抑制PI3K-Akt信號(hào)通路中Akt磷酸化,提示SLFN5抗增殖作用的機(jī)制是多因素、多環(huán)節(jié)參與的復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控機(jī)制。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1545781