本文關(guān)鍵詞： 乳腺癌 自噬 表觀遺傳學(xué) YY1 MIR372 SQSTM1/p62 LC3　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景乳腺癌是全球范圍內(nèi)女性癌癥發(fā)病率第一位的惡性腫瘤。自噬是細(xì)胞在應(yīng)激條件下降解自身細(xì)胞質(zhì)甚至細(xì)胞器以適應(yīng)生存的關(guān)鍵生理反應(yīng),近年來的研究發(fā)現(xiàn),細(xì)胞自噬水平紊亂與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。癌基因YYl轉(zhuǎn)錄因子(Yin Yang 1)已被報(bào)道在包括乳腺癌在內(nèi)的惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用,但其在乳腺腫瘤細(xì)胞自噬的相關(guān)調(diào)控機(jī)制尚未見報(bào)道。目的目前已有研究證實(shí)YY1涉及的致癌性機(jī)制可能有抑制細(xì)胞周期阻滯、抑制凋亡、抑制細(xì)胞分化等,但其在自噬中的調(diào)控作用卻未見報(bào)道。我們希望通過一系列體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)來明確YY1基因是否通過影響自噬而在乳腺癌中發(fā)揮癌基因的生物學(xué)功能,探索其涉及到在腫瘤細(xì)胞自噬中的相應(yīng)分子調(diào)控機(jī)制。方法用蛋白免疫印跡(Western Blotting)、免疫組化方法檢測乳腺癌細(xì)胞水平和組織水平Y(jié)1、SQSTM1的表達(dá)情況及二者相關(guān)性；使用YY1 siRNA轉(zhuǎn)染乳腺癌細(xì)胞MCF7和T47D,用蛋白酶體抑制劑和不同的自噬抑制劑處理后熒光顯微鏡觀察、MTS等手段確認(rèn)YY1對(duì)SQSTM1的調(diào)控；通過生物信息學(xué)軟件分析可能靶向SQSTM1的miRNAs (microRNAs),實(shí)時(shí)熒光定量PCR (Real Time quantita-tive PCR)檢測miRNA;運(yùn)用染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation)實(shí)驗(yàn)技術(shù)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)明確YYl對(duì)MIR372的表達(dá)調(diào)控,并通過甲基化特異性PCR (Methylation specific PCR)和甲基化DNA免疫共沉淀(Methylat-ed DNA Immunoprecipitation)驗(yàn)證YY1對(duì)MIR372啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化水平的影響；構(gòu)建SK-BR-3 YY1 shRNA穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系,將其與對(duì)照組細(xì)胞懸液接種于兩組隨機(jī)分組的裸鼠皮下建立裸鼠成瘤模型,取瘤稱重,繪制生長曲線。結(jié)果本研究中首次證實(shí)YY1可以通過調(diào)控細(xì)胞自噬來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。與正常乳腺上皮細(xì)胞和正常乳腺組織相比,YYl在乳腺癌細(xì)胞和原發(fā)乳腺癌組織中均呈高表達(dá)狀態(tài)；同時(shí),體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均證實(shí)YY1和SQSTM1能促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的生長,其蛋白水平表達(dá)呈正相關(guān)(p0.05)。YY1既不是通過影響SQSTM1的蛋白穩(wěn)定性也不是通過影響其轉(zhuǎn)錄水平而影響SQSTM1的蛋白表達(dá)的。而MIR372則是唯一一個(gè)對(duì)SQSTM1的轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)行調(diào)控并且其本身受YY1調(diào)控的miRNA。過表達(dá)MIR372可以表現(xiàn)出與YY1敲減后一致的細(xì)胞活力下降和自噬阻滯等一系列細(xì)胞表型和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果。而在YY1 siRNA處理敲減YY1基礎(chǔ)上再敲減MIR372可以逆轉(zhuǎn)YY1敲減所致細(xì)胞活力下降和自噬阻滯等一系列細(xì)胞表型以及SQSTM1蛋白的下調(diào)。EBSS誘導(dǎo)細(xì)胞自噬發(fā)生時(shí),YY1和SQSTM1蛋白水平上調(diào),MIR372水平下調(diào),證實(shí)了YY1-MIR372-SQSTM1軸確實(shí)在腫瘤細(xì)胞的生理性自噬過程中產(chǎn)生調(diào)控作用,最終參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。結(jié)論YY1可以通過對(duì)乳腺癌細(xì)胞自噬的表觀遺傳學(xué)調(diào)控來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其作用機(jī)制是通過YY1-MIR372-SQSTM1軸實(shí)現(xiàn)對(duì)自噬的調(diào)控。
[Abstract]:Background Breast cancer is the first malignant tumor in women worldwide. Autophagy is the key physiological response of cells to degrade their cytoplasm or even cell organelles to adapt to survival under stress. The disorder of autophagy level is closely related to tumorigenesis and development. The oncogene YYl transcription factor Yin Yang 1 has been reported to play an important role in malignant tumors, including breast cancer. However, the regulation mechanism of autophagy in breast tumor cells has not been reported. Objective it has been confirmed that the carcinogenic mechanisms involved in YY1 may include inhibition of cell cycle arrest, inhibition of apoptosis, inhibition of cell differentiation, and so on. However, its role in autophagy has not been reported. We hope to find out whether YY1 gene plays a biological role in breast cancer by affecting autophagy through a series of experiments in vivo and in vitro. Methods Western blotting was used to detect the expression of Y1CS-SQSTM1 in breast cancer cells by immunohistochemistry. YY1 siRNA was used to transfect MCF7 and T47D into breast cancer cells. After treated with proteasome inhibitor and different autophagy inhibitor, fluorescence microscopy was used to confirm the regulation of YY1 on SQSTM1. SQSTM1 microRNA was analyzed by bioinformatics software, and real Time quantita-tive PCR was used to detect miRNAs. The expression regulation of YYl on MIR372 was determined by chromatin co-precipitation assay and double luciferase report system. The effect of YY1 on the methylation level of MIR372 promoter region was tested by methylation specific PCR method specific specific and methylated DNA immunoprecipitation, and a stable SK-BR-3 YY1 shRNA cell line was constructed. The model of tumorigenesis was established by inoculating the cell suspension with the control group into two groups of nude mice randomly divided into two groups, and the tumor was weighed. Results in this study, it is the first time that YY1 can influence the development of tumor by regulating autophagy. Compared with normal breast epithelial cells and normal breast tissues, YYl is present in breast cancer cells and primary breast cancer. High expression was found in all tissues. At the same time, in vivo and in vitro experiments confirmed that YY1 and SQSTM1 can promote the growth of breast cancer cells. The expression of MIR372 protein was positively correlated with the expression of SQSTM1 protein, and MIR372 was the only one that regulated the posttranscriptional level of SQSTM1 and had no effect on the protein stability of SQSTM1 or on the expression of SQSTM1 protein by affecting the transcriptional level of SQSTM1. The overexpression of MIR372, which is regulated by YY1, can show a series of cell phenotypes and in vivo experimental results, such as cell viability decline and autophagy arrest, which are consistent with YY1 knockout. The YY1 siRNA treatment of knockdown YY1 can also reduce MIR372. It can reverse a series of cell phenotypes such as cell viability decline and autophagy arrest induced by YY1 knockout and down-regulation of SQSTM1 protein. The levels of YY1 and SQSTM1 protein upregulate the down-regulation of MIR372 during the induction of autophagy. It is proved that the YY1-MIR372-SQSTM1 axis does play a regulatory role in the physiological autophagy of tumor cells, and eventually participate in the development of tumor. Conclusion YY1 can affect the development of tumor through epigenetic regulation of autophagy of breast cancer cells. The mechanism is that autophagy is regulated by YY1-MIR372-SQSTM1 axis.
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R737.9

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