本文關鍵詞： 乳腺癌 自噬 表觀遺傳學 YY1 MIR372 SQSTM1/p62 LC3　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景乳腺癌是全球范圍內女性癌癥發(fā)病率第一位的惡性腫瘤。自噬是細胞在應激條件下降解自身細胞質甚至細胞器以適應生存的關鍵生理反應,近年來的研究發(fā)現,細胞自噬水平紊亂與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關。癌基因YYl轉錄因子(Yin Yang 1)已被報道在包括乳腺癌在內的惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用,但其在乳腺腫瘤細胞自噬的相關調控機制尚未見報道。目的目前已有研究證實YY1涉及的致癌性機制可能有抑制細胞周期阻滯、抑制凋亡、抑制細胞分化等,但其在自噬中的調控作用卻未見報道。我們希望通過一系列體內外實驗來明確YY1基因是否通過影響自噬而在乳腺癌中發(fā)揮癌基因的生物學功能,探索其涉及到在腫瘤細胞自噬中的相應分子調控機制。方法用蛋白免疫印跡(Western Blotting)、免疫組化方法檢測乳腺癌細胞水平和組織水平Y1、SQSTM1的表達情況及二者相關性；使用YY1 siRNA轉染乳腺癌細胞MCF7和T47D,用蛋白酶體抑制劑和不同的自噬抑制劑處理后熒光顯微鏡觀察、MTS等手段確認YY1對SQSTM1的調控；通過生物信息學軟件分析可能靶向SQSTM1的miRNAs (microRNAs),實時熒光定量PCR (Real Time quantita-tive PCR)檢測miRNA;運用染色質免疫共沉淀(Chromatin Immunoprecipitation)實驗技術和雙熒光素酶報告系統(tǒng)明確YYl對MIR372的表達調控,并通過甲基化特異性PCR (Methylation specific PCR)和甲基化DNA免疫共沉淀(Methylat-ed DNA Immunoprecipitation)驗證YY1對MIR372啟動子區(qū)域的甲基化水平的影響；構建SK-BR-3 YY1 shRNA穩(wěn)定表達細胞系,將其與對照組細胞懸液接種于兩組隨機分組的裸鼠皮下建立裸鼠成瘤模型,取瘤稱重,繪制生長曲線。結果本研究中首次證實YY1可以通過調控細胞自噬來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。與正常乳腺上皮細胞和正常乳腺組織相比,YYl在乳腺癌細胞和原發(fā)乳腺癌組織中均呈高表達狀態(tài)；同時,體內外實驗均證實YY1和SQSTM1能促進乳腺癌細胞的生長,其蛋白水平表達呈正相關(p0.05)。YY1既不是通過影響SQSTM1的蛋白穩(wěn)定性也不是通過影響其轉錄水平而影響SQSTM1的蛋白表達的。而MIR372則是唯一一個對SQSTM1的轉錄后水平進行調控并且其本身受YY1調控的miRNA。過表達MIR372可以表現出與YY1敲減后一致的細胞活力下降和自噬阻滯等一系列細胞表型和體內實驗結果。而在YY1 siRNA處理敲減YY1基礎上再敲減MIR372可以逆轉YY1敲減所致細胞活力下降和自噬阻滯等一系列細胞表型以及SQSTM1蛋白的下調。EBSS誘導細胞自噬發(fā)生時,YY1和SQSTM1蛋白水平上調,MIR372水平下調,證實了YY1-MIR372-SQSTM1軸確實在腫瘤細胞的生理性自噬過程中產生調控作用,最終參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。結論YY1可以通過對乳腺癌細胞自噬的表觀遺傳學調控來影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展,其作用機制是通過YY1-MIR372-SQSTM1軸實現對自噬的調控。
[Abstract]:Background Breast cancer is the first malignant tumor in women worldwide. Autophagy is the key physiological response of cells to degrade their cytoplasm or even cell organelles to adapt to survival under stress. The disorder of autophagy level is closely related to tumorigenesis and development. The oncogene YYl transcription factor Yin Yang 1 has been reported to play an important role in malignant tumors, including breast cancer. However, the regulation mechanism of autophagy in breast tumor cells has not been reported. Objective it has been confirmed that the carcinogenic mechanisms involved in YY1 may include inhibition of cell cycle arrest, inhibition of apoptosis, inhibition of cell differentiation, and so on. However, its role in autophagy has not been reported. We hope to find out whether YY1 gene plays a biological role in breast cancer by affecting autophagy through a series of experiments in vivo and in vitro. Methods Western blotting was used to detect the expression of Y1CS-SQSTM1 in breast cancer cells by immunohistochemistry. YY1 siRNA was used to transfect MCF7 and T47D into breast cancer cells. After treated with proteasome inhibitor and different autophagy inhibitor, fluorescence microscopy was used to confirm the regulation of YY1 on SQSTM1. SQSTM1 microRNA was analyzed by bioinformatics software, and real Time quantita-tive PCR was used to detect miRNAs. The expression regulation of YYl on MIR372 was determined by chromatin co-precipitation assay and double luciferase report system. The effect of YY1 on the methylation level of MIR372 promoter region was tested by methylation specific PCR method specific specific and methylated DNA immunoprecipitation, and a stable SK-BR-3 YY1 shRNA cell line was constructed. The model of tumorigenesis was established by inoculating the cell suspension with the control group into two groups of nude mice randomly divided into two groups, and the tumor was weighed. Results in this study, it is the first time that YY1 can influence the development of tumor by regulating autophagy. Compared with normal breast epithelial cells and normal breast tissues, YYl is present in breast cancer cells and primary breast cancer. High expression was found in all tissues. At the same time, in vivo and in vitro experiments confirmed that YY1 and SQSTM1 can promote the growth of breast cancer cells. The expression of MIR372 protein was positively correlated with the expression of SQSTM1 protein, and MIR372 was the only one that regulated the posttranscriptional level of SQSTM1 and had no effect on the protein stability of SQSTM1 or on the expression of SQSTM1 protein by affecting the transcriptional level of SQSTM1. The overexpression of MIR372, which is regulated by YY1, can show a series of cell phenotypes and in vivo experimental results, such as cell viability decline and autophagy arrest, which are consistent with YY1 knockout. The YY1 siRNA treatment of knockdown YY1 can also reduce MIR372. It can reverse a series of cell phenotypes such as cell viability decline and autophagy arrest induced by YY1 knockout and down-regulation of SQSTM1 protein. The levels of YY1 and SQSTM1 protein upregulate the down-regulation of MIR372 during the induction of autophagy. It is proved that the YY1-MIR372-SQSTM1 axis does play a regulatory role in the physiological autophagy of tumor cells, and eventually participate in the development of tumor. Conclusion YY1 can affect the development of tumor through epigenetic regulation of autophagy of breast cancer cells. The mechanism is that autophagy is regulated by YY1-MIR372-SQSTM1 axis.
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.9

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本文編號：1545345