本文關(guān)鍵詞： 食管鱗癌 AJUBA ERK 基質(zhì)金屬蛋白酶10 基質(zhì)金屬蛋白酶13 5-羥甲基胞嘧啶 甲基胞嘧啶雙加氧酶 食管鱗癌 術(shù)后生存　出處：《北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：在全世界范圍內(nèi),食管癌的發(fā)病率在全部惡性腫瘤中排名第8位,其死亡率在全部惡性腫瘤中排名第6位。食管癌以鱗癌為主要病理類型,在我國食管鱗癌占到食管癌總數(shù)的90%以上。在過去的幾十年中,在食管癌的診斷、分期以及治療等方面都取得了較大的進步,但是食管癌的總體生存率仍然沒有明顯改善,總體五年生存率仍然在15%至25%之間。因此亟需研究食管癌發(fā)生發(fā)展過程中具體的分子機制,為食管癌尋找新的腫瘤標志物和治療靶點。AJUBA屬于Zyxin/Ajuba家族成員,包含三個串聯(lián)重復(fù)的LIM結(jié)構(gòu)域和富含脯氨酸的Pre-LIM結(jié)構(gòu)域,能以腳手架蛋白的身份與多種蛋白或DNA結(jié)合,參與組織器官的發(fā)育調(diào)控,并且在細胞粘附、增殖、遷移、細胞命運決定等方面發(fā)揮作用。到目前為止AJUBA在食管鱗癌中的表達水平,具體的生物學(xué)功能以及作用機制尚不明確。在本研究中,我們首先分析了表達譜芯片中179對食管鱗癌及相應(yīng)癌旁組織中AJUBA的mRNA水平,并且使用免疫組化的方法在81例食管鱗癌組織和60例癌旁組織中進行AJUBA蛋白水平的驗證,結(jié)果顯示在食管鱗癌組織中存在AJUBA表達水平的廣泛上調(diào),進一步的分析發(fā)現(xiàn)AJUBA的高表達與腫瘤組織的分化和T分期相關(guān)。通過慢病毒載體系統(tǒng)在食管鱗癌細胞KYSE450、 KYSE510和KYSE180中敲降A(chǔ)JUBA基因能顯著抑制腫瘤細胞的增殖和遷移、侵襲能力,反之,在KYSE450和KYSE510中穩(wěn)定過表達AJUBA則能促進腫瘤細胞的遷移和侵襲。裸鼠成瘤實驗和尾靜脈注射肺定植實驗證實了AJUBA在體內(nèi)也能促進食管鱗癌細胞的增殖和遠處轉(zhuǎn)移。RNA測序是一種全轉(zhuǎn)錄本分析技術(shù),可測出包括mRNA在內(nèi)的轉(zhuǎn)錄組序列,反映其表達水平,具有高通量,高敏感度,高準確度等優(yōu)點。在本研究中我們敲降KYSE450. KYSE510和KYSE180由AJUBA的表達水平后,使用RNA測序的方法檢測AJUBA敲降前后差異表達的基因并將差異表達基因進行GO功能富集分析,發(fā)現(xiàn)AJUBA敲降前后差異表達的基因主要在細胞粘附、運動、連接等方面發(fā)揮作用。在這些差異表達的基因中,MMP10和MMP13的表達水平在AJUBA敲降后顯著降低,分別降低5.6倍和5.5倍。進一步分析179例食管鱗癌組織中MMP10、 MMP13和AJUBA的mRNA表達水平,發(fā)現(xiàn)MMP10, MMP13與AJUBA之間呈正相關(guān)關(guān)系,相關(guān)系數(shù)分別為r=0.441,P0.001和r=0.404,P0.001。探討機制后發(fā)現(xiàn),AJUBA能夠通過增強ERK的磷酸化水平上調(diào)MMP10和MMP13的表達,從而促進腫瘤細胞的侵襲轉(zhuǎn)移。此外,AJUBA還能增強食管鱗癌細胞對順鉑誘導(dǎo)凋亡的抵抗作用,促進腫瘤細胞的存活。綜上所述,我們的研究證實,AJUBA基因在食管鱗癌組織中存在普遍的高表達現(xiàn)象,高表達的AJUBA能促進食管鱗癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及增強腫瘤細胞對順鉑誘導(dǎo)凋亡的抵抗,有可能成為食管鱗癌治療的新靶點。DNA胞嘧啶甲基化是最重要的表觀遺傳學(xué)修飾之一。DNA胞嘧啶甲基化參與了基因組印記、X染色體失活、基因表達調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)過程。在哺乳動物基因組中,胞嘧啶甲基化主要發(fā)生于CpG二核苷酸處,最初由從頭甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b催化生成,在DNA復(fù)制過程中,生成的5-甲基胞嘧啶(5-mC)在維持性甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt1的作用下被維持下來。甲基胞嘧啶雙加氧酶(TET),是一類Fe(2+)和a-酮戊二酸依賴性的雙加氧酶,能夠催化5-mC形成5-羥甲基胞嘧啶(5-hmC),生成的5-hmC還能進一步被TET酶催化生成5-甲酰胞嘧啶(5fC)和5-羧基胞嘧啶(5caC),在DNA去甲基化中發(fā)揮重要作用。在哺乳動物細胞中共有3個TET基因,分別為TET1,TET2和TET3,TET1/2/3均能催化5-mC形成5-hmC,并且具有組織特異性。研究報道在多種腫瘤中發(fā)現(xiàn)5-hmC水平的降低,并且降低的5-hmC可以作為腫瘤的一個重要的表觀遺傳學(xué)標記。在本研究中,我們使用免疫組化法檢測了173例食管鱗癌組織和91例相應(yīng)遠癌正常組織中5-hmC的水平；并在另外50對食管鱗癌組織和相應(yīng)遠癌正常組織中用DNA斑點雜交法檢測了5-hmC的水平。進一步利用實時定量PCR (RT-qPCR)檢測了這50對食管鱗癌組織和相應(yīng)遠癌正常組織中TET1, TET2和TET3的mRNA表達水平,并與5-hmC水平進行了相關(guān)性分析。免疫組化結(jié)果顯示在91例遠癌正常組織中,56例為5-hmC陽性,陽性比例為62%；在173例食管鱗癌組織中,82例為5-hmC陽性,陽性比例為47%,顯著低于遠癌正常組織(P=0.029)。DNA斑點雜交的結(jié)果進一步支持了5-hmC在食管鱗癌中的水平顯著低于相應(yīng)的遠癌正常組織(P0.0001)。我們進一步分析了5-hmC水平與食管鱗癌患者臨床病理因素及術(shù)后生存之間的關(guān)系,結(jié)果顯示在食管鱗癌中,5-hrnC的表達下調(diào)與食管鱗癌患者的預(yù)后不良顯著相關(guān)(P=0.043)。多因素Cox回歸分析進一步表明5-hmC表達下調(diào)是食管鱗癌患者獨立的不良預(yù)后因素但R=1.569,P=0.029)。RT-qPCR結(jié)果顯示TET2和TET3在食管癌中的表達水平顯著低于相應(yīng)的遠癌正常組織(TET2,P0.0001；TET3,P=0.009),進一步分析發(fā)現(xiàn)5-hmC水平的降低與TET2表達水平下調(diào)顯著正相關(guān)(r=0.405,P=0.004)。除了TET基因的表達下調(diào)外,研究報道TET基因或異檸檬酸脫氫酶1和2(IDH1/2)基因的突變也可導(dǎo)致5-hmC水平的降低。在免疫組化檢測的173例食管鱗癌組織中,105例標本具有全外顯子的測序數(shù)據(jù)。我們分析了這105例標本中TET基因和IDH基因序列的異常,結(jié)果表明12例病例發(fā)生了TET或IDH1基因序列變異,這105例標本中未發(fā)現(xiàn)IDH2基因序列變異。進一步分析表明發(fā)生TET或IDH1基因序列變異的標本中,5-hmC水平低于未發(fā)生TET或IDH1基因序列變異的病例,但差異暫不具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.051)。綜上所述,本研究結(jié)果表明食管鱗癌中5-hmC水平發(fā)生顯著下調(diào),并且5-hmC的表達下調(diào)是食管鱗癌患者獨立不良預(yù)后因素。
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【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.1
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本文編號：1544923