本文關(guān)鍵詞： 梓醇 細(xì)胞增殖 細(xì)胞凋亡 Caspase-3 Caspase-9 miRNA-200 PI3K-AKT信號通路　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景及目的結(jié)直腸癌是全世界范圍內(nèi)一種常見的消化道腫瘤,且近年來發(fā)病率表現(xiàn)出上升的趨勢。明確結(jié)直腸癌的發(fā)病病因及分子機(jī)制,提高其早期診斷水平及治療效果是結(jié)直腸癌研究的重點。microRNA(miRNA)是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小分子RNA,大量研究證據(jù)表明miRNA幾乎參與了所有的生命活動,在細(xì)胞生長、發(fā)育、增殖、分化以及細(xì)胞凋亡等方面發(fā)揮調(diào)控作用。同時發(fā)現(xiàn)miRNA在腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制中扮演了不可或缺的角色,已經(jīng)成為分子腫瘤學(xué)研究的新熱點。miRNA-200家族是近期研究較熱的分子,有大量研究對miRNA-200家族與腫瘤發(fā)生發(fā)展關(guān)系及機(jī)制進(jìn)行了研究,而miRNA-200家族與結(jié)直腸癌細(xì)胞的關(guān)系報道相對罕見。PI3K蛋白家族參與細(xì)胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)等多種細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)。PI3K的激活導(dǎo)致質(zhì)膜上產(chǎn)生第二信使PIP3,PIP3與AKT結(jié)合,導(dǎo)致AKT活化生成P-AKT,其通過磷酸化各種酶、激酶以及轉(zhuǎn)錄因子等下游因子調(diào)節(jié)細(xì)胞的功能,并發(fā)揮其抗凋亡作用。AKT也可以通過抑制蛋白水解酶Caspase-9的活性進(jìn)而阻止凋亡級聯(lián)反應(yīng)的激活。近年來發(fā)現(xiàn),PI3K及AKT所組成的信號通路在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、治療及轉(zhuǎn)歸中均發(fā)揮著重要作用,并且己經(jīng)成為腫瘤診斷及治療的新靶點。隨著miRNA研究的逐步深入,多項研究表明miRNA與PI3K-AKT通路之間存在著相關(guān)性,miRNA可以直接或者間接調(diào)節(jié)PI3K-AKT通路。也有研究表明miRNA-200c的表達(dá)可以誘導(dǎo)結(jié)直腸癌干細(xì)胞特性和PI3K-AKT通路的活性。因此miRNA-200家族、PI3K-AKT信號通路以及結(jié)直腸癌之間的相關(guān)性及分子機(jī)制有待進(jìn)一步研究及明確。梓醇是地黃的主要活性成分之一,具有多種藥理學(xué)作用,如利尿、導(dǎo)瀉、降糖、保肝和抗衰老作用,亦有研究表明梓醇具有抗腫瘤作用。因此,結(jié)合上述研究基礎(chǔ)及大量相關(guān)文獻(xiàn)報道,我們確立了"梓醇對結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT-116細(xì)胞株增殖、凋亡的影響及作用機(jī)制的研究"這一課題,研究目的是觀察梓醇溶液對結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞株細(xì)胞增殖及細(xì)胞凋亡的影響,并探討其作用機(jī)制,進(jìn)而確定梓醇在結(jié)直腸癌方面的治療價值。方法1.應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100(μig/ml)的梓醇處理HCT-116細(xì)胞,置于37℃C、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng),持續(xù)24h、48h和72h,應(yīng)用酶聯(lián)免疫檢測儀(ELISA法)進(jìn)行MTT試驗檢測HCT-116細(xì)胞的吸光度,計算細(xì)胞增殖率,以研究梓醇對細(xì)胞增殖的影響。2.HCT-116細(xì)胞經(jīng)過不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理48h后,利用Caspase-3及Caspase-9活性檢測試劑盒檢測Caspase-3及Caspase-9的活性,研究梓醇對HCT-116細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性的影響。3.應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理HCT-116細(xì)胞48h后,應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙標(biāo)法對梓醇誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞細(xì)胞凋亡的能力進(jìn)行檢測,用流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡比率。4.應(yīng)用DAPI染色試驗檢測不同濃度(0、25、50、100μμg/ml)的梓醇處理后HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞核形態(tài),應(yīng)用熒光顯微鏡在紫外線下觀察,設(shè)定在340nm波長處觀察和拍攝HCT-116細(xì)胞細(xì)胞核的形態(tài),研究梓醇對HCT-116細(xì)胞核形態(tài)方面的抗癌效果。5.應(yīng)用WesternBlot法分析不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理后HCT-116細(xì)胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白的表達(dá),研究梓醇對PI3K-AKT信號通路的影響。6.應(yīng)用熒光定量PCI技術(shù)檢測不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理HCT-116細(xì)胞48h后,采用TRIzol 一步法抽提細(xì)胞樣品中的總RNA。按照High Capacity cDNA Reverse Transcription kit 試劑盒說明書的操作步驟,應(yīng)用 ABI7500(TAKARA,日本)熒光定量PCI系統(tǒng)進(jìn)行擴(kuò)增,檢測HCT-116細(xì)胞中miRNA-200的表達(dá)。7.將 PI3K 抑制劑(LY294002,5μM)添加到 HCT-116 細(xì)胞,重復(fù) Western Blot測定HCT-116細(xì)胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)水平,重復(fù)熒光定量PCI技術(shù)以檢測HCT-116細(xì)胞中miRNA-200的表達(dá),與單純梓醇處理組進(jìn)行比較,研究下調(diào)PI3K-AKT信號通路后對梓醇抗腫瘤作用機(jī)制的影響。結(jié)果1.梓醇對細(xì)胞增殖的影響應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理HCT-116細(xì)胞,持續(xù)24h、48h和72h,進(jìn)行MTT試驗檢測HCT-116細(xì)胞的吸光度。結(jié)果顯示HCT-116細(xì)胞的吸光度明顯降低,表明梓醇處理后HCT-116細(xì)胞株的細(xì)胞增殖被抑制,而且抑制效率是劑量和時間依賴性的。2.梓醇對HCT-116細(xì)胞Caspase-3和Caspase-9活性的影響當(dāng)HCT-116細(xì)胞經(jīng)過處理48h時,與對照組(0μg/ml的梓醇組)相比,濃度為50、10Oμg/ml梓醇溶液處理組與對照組比較Caspase-3和Caspase-9的活性水平在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(p0.05),說明Caspase-3和Caspase-9活性均明顯提高且均呈劑量依賴性關(guān)系。3.梓醇誘導(dǎo)HCT-116細(xì)胞凋亡的影響應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理 48h 后,Annexin V-FITC/PI雙染標(biāo)記法檢測細(xì)胞凋亡情況,各濃度處理組HCT-116細(xì)胞都發(fā)生了一定程度的凋亡,與對照組(0μg/ml的梓醇組)相比,濃度為25、50、100μg/ml梓醇處理后的早期凋亡(右下象限)及晚期凋亡(右上象限)細(xì)胞百分比均顯著提高,其中濃度為50、100μg/ml梓醇溶液處理組與對照組比較凋亡百分比的提高存在統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05),說明凋亡率明顯提高且呈劑量依賴性關(guān)系。4.梓醇對HCT-116細(xì)胞核形態(tài)的影響應(yīng)用不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇溶液處理HCT-116細(xì)胞48小時后,熒光顯微鏡下觀察,可見梓醇(50或100μμg/ml)影響了 HCT-116細(xì)胞的核形態(tài),呈現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞特征,說明與對照組相比,梓醇顯著加速了 HCT-116細(xì)胞的細(xì)胞核凋亡。5.梓醇對PI3K-AKT信號通路的影響經(jīng)過不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理48h后,應(yīng)用Western Blot法檢測了 PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表達(dá),與對照組(Oμg/ml的梓醇組)相比,濃度為25、50、100μg/ml梓醇處理后HCT-116細(xì)胞的PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表達(dá)均較前減少,其中濃度為50、100μg/ml梓醇溶液處理組與對照組比較在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(p0.05),表明梓醇對PI3K-AKT信號通路起到抑制作用。6.梓醇對HCT-116細(xì)胞miRNA-200表達(dá)的影響經(jīng)過不同濃度(0、25、50、100μg/ml)的梓醇處理48h后,我們應(yīng)用熒光定量PCR技術(shù)檢測了 HCT-116細(xì)胞中miRNA-200的表達(dá),與對照組(Oμg/ml的梓醇組)相比miRNA-200的表達(dá)增加,其中濃度為50、1OOμg/ml梓醇溶液處理組與對照組比較在統(tǒng)計學(xué)上有顯著性差異(p0.05)。7.梓醇處理時下調(diào)PI3K-AKT信號通路對PI3K-AKT表達(dá)及細(xì)胞增殖的影響將PI3K抑制劑(LY294002,5μμM)添加到HCT-116細(xì)胞中,與單純梓醇(5μg/ml)處理組相比,PI3K抑制劑+梓醇處理組進(jìn)一步阻斷了 HCT-116細(xì)胞中PI3K-AKT信號通路,抑制了 PI3K和p-AKT蛋白質(zhì)的表達(dá)。同時,與單純梓醇(50μg/ml)處理組相比,同時下調(diào)PI3K-AKT通路有效地增強(qiáng)了梓醇對HCT-116細(xì)胞的抗增殖作用。8.下調(diào)PI3K-AKT信號通路對HCT-116細(xì)胞中miRNA-200表達(dá)的影響在將PI3K抑制劑(LY294002,5μM)添加到HCT-116細(xì)胞,下調(diào)PI3K-AKT信號通路后,測定HCT-116細(xì)胞中miRNA-200的表達(dá)水平,顯示與單純梓醇(50μg/ml)處理組相比,下調(diào)PI3K-AKT后,PI3K抑制劑+梓醇處理組顯著增強(qiáng)了HCT-116細(xì)胞中miRNA-200的表達(dá)。結(jié)論1.MTT試驗檢測發(fā)現(xiàn)梓醇能夠抑制結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞株的細(xì)胞增殖。2.梓醇溶液能夠提高結(jié)直腸癌HCT-116細(xì)胞株中Caspase-3和Caspase-9的活性,提示梓醇可能具有促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用。應(yīng)用AnnexinV-FITC/PI雙染標(biāo)記法發(fā)現(xiàn)梓醇處理后HCT-116細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞凋亡,且熒光顯微鏡下觀察見其核形態(tài)呈現(xiàn)出典型的凋亡細(xì)胞特征。3.梓醇處理后HCT-116細(xì)胞的PI3K、p-AKT及AKT蛋白的表達(dá)均較前減少,表明梓醇對PI3K-AKT信號通路起到抑制作用;HCT-116細(xì)胞中miRNA-200的表達(dá)增加,提示梓醇對HCT-116細(xì)胞的抗腫瘤作用可能與miRNA-200家族有關(guān)。4.將PI3K抑制劑(LY294002,5μM)添加到HCT-116細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)與單純梓醇處理組進(jìn)行比較,HCT-116細(xì)胞中PI3K、p-AKT、AKT蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步降低,miRNA-200的表達(dá)顯著增強(qiáng),表明PI3K抑制劑可以進(jìn)一步抑制PI3K-AKT信號通路,并增加了 miRNA-200家族的表達(dá),提示其可能與梓醇抗腫瘤作用機(jī)制有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.34

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