發(fā)布時間：2018-02-27 16:26

  本文關鍵詞： ABCB1 ABCG2 肝再生增強因子 肝細胞癌 多藥耐藥性　出處：《首都醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的:肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是全球第五大最常見惡性腫瘤,而其致死率在惡性腫瘤中居于第三位。更為嚴峻的是,HCC患病率仍呈逐年上升趨勢。近年來,由于影像學診斷技術的發(fā)展,HCC早期診斷率較過去顯著提升,但其治療效果依舊未能很好解決。根據(jù)腫瘤分期,HCC的治療手段主要分為手術,放療及化療。由于HCC對多種化療藥物具有固有的多藥耐藥性(multidrug resistance,MDR),使其化療效果一直不盡如人意。肝再生增強因子(augmenter of liver regeneration,ALR),又稱肝刺激因子(hepatic stimulator substance,HSS),最初被報道發(fā)現(xiàn)于肝部分切除術后的大鼠肝臟中,可以刺激肝臟再生。實驗室及臨床研究均證實ALR與多種肝臟疾病密切相關。近期發(fā)現(xiàn),在肝硬化、膽管細胞癌及HCC患者的肝組織中,ALR基因及蛋白表達水平均呈升高態(tài)勢。另外,有報道稱在HCC患者中,ALR表達量與其腫瘤分級及轉移性呈負相關。盡管已經有大量研究證明,HCC高轉移特點與耐藥性密切相關,但迄今,有關ALR是否與HCC耐藥有關仍不甚明了。而本實驗研究目的旨在探明ALR表達與HCC耐藥性之關系并試圖探究其機制。實驗方法:1.為確信ALR表達與HCC耐藥性之關系,本實驗中使用了穩(wěn)定轉染ALR基因的HepG2細胞系(ALR-tx)及穩(wěn)定敲減ALR基因的HepG2細胞系(ALR-sh RNA),并采用HepG2野生型細胞系Mock及穩(wěn)定轉染空載體的HepG2細胞系Vector-tx作為對照。以上細胞用不同劑量抗腫瘤藥物---阿霉素(doxorubicin,0、0.5、1、2、4、8及16μg/ml)處理48 h后,測定細胞存活情況并計算半數(shù)抑制劑量(IC_(50))。并應用克隆抑制實驗測定單個細胞藥物處理后的增殖潛力。為進一步證實ALR基因表達與抗腫瘤效果的關系是否具有細胞特異性,本實驗采用其他HCC細胞系(Bel-7402,Hep3B和Huh7),觀察ALR轉染與阿霉素引起的腫瘤生長抑制的關系。2.為進一步證實ALR與HCC耐藥相關,本實驗建立了裸鼠荷瘤模型。在NOD/SCID小鼠左側腋下注射等量的ALR-tx或ALR-shRNA細胞,并在小鼠的右側腋下注射等量的Mock細胞作為對照。腹腔注射給予阿霉素治療(1.8 mg/kg/3q,即每3天給藥)。治療21天后,測量腫瘤的大小,并計算相對腫瘤體積及相對腫瘤增值率。并通過HE染色及透射電鏡技術觀察腫瘤的超微結構。3.為研究ALR促進HCC對阿霉素的敏感性是否與細胞凋亡相關,本實驗采用阿霉素(1.88μg/ml)處理細胞24 h及48 h后,檢測caspase活性,用western blot技術測定PARP剪切體的含量,并用流式細胞技術分析細胞凋亡情況。4.為進一步明確ALR表達與HCC耐藥的機制,實驗繼續(xù)觀察阿霉素在細胞內駐留情況。用不同劑量的阿霉素處理ALR-tx及ALR-shRNA的HepG2細胞及Bel-7402細胞2 h,用高內涵技術測定細胞內藥物含量;并進一步利用激光共聚焦顯微鏡觀察進入細胞內的藥物含量。5.在確定ALR表達對HCC耐藥的影響與阿霉素細胞內駐留有關之后,實驗繼續(xù)研究多藥耐藥相關轉運蛋白(MDR-ABC)是否受到ALR的調節(jié)從而影響阿霉素細胞內駐留,本實驗采用qRT-PCR技術測定細胞內部分MDR-ABC家族分子(ABCB1,ABCC1,ABCC10及ABCG2)mRNA表達量,并用western blot技術測定了細胞中及腫瘤組織中ABCB1與ABCG2的蛋白表達量。6.實驗中,采用質粒轉染技術,在ALR-shRNA細胞中重新表達ALR,并檢測ABCB1和ABCG2的表達,進一步判定ALR基因表達參與調節(jié)ABCB1與ABCG2分子,從而阻止抗癌藥物在HCC細胞外排。并通過共聚焦顯微鏡和高含量分析儀測定阿霉素的細胞內含量的變化。7.實驗測定了當細胞ALR含量變化時,Snail及磷酸化AKT的變化情況,初步探索了ALR是否通過調節(jié)AKT/Snail/MDR-ABC途徑影響ABCB1及ABCG2的表達。實驗結果:1.ALR-shRNA細胞的IC_(50)(2.90μg/ml)顯著高于Vector-tx(1.88μg/ml)細胞,而ALR-tx細胞IC_(50)值(1.25μg/ml)則明顯降低。在應用1.88μg/ml阿霉素處理細胞48 h后更換完全培養(yǎng)基培養(yǎng)14 d后,ALR-shRNA細胞的克隆形成率為ALR-tx細胞的4倍。其他HCC細胞系中也存在轉染ALR后,腫瘤細胞對阿霉素敏感性增高的現(xiàn)象。2.在裸鼠荷瘤試驗中,在經阿霉素治療后,Mock組的腫瘤生長抑制率為54.12%,ALR-tx組的腫瘤生長抑制率達到82.37%,而ALR-shRNA組的腫瘤生長抑制率僅為9.94%。光鏡下觀察各組腫瘤組織切片,經過阿霉素治療后,Mock組腫瘤組織切片隨處可見局灶性壞死,ALR-tx組壞死呈大片狀,與此相反,ALR-shRNA組壞死較輕。透射電鏡顯示,經過阿霉素治療后,Mock組腫瘤組織細胞內可見細胞核出現(xiàn)凋亡核型,ALR-tx組已基本不能分辨細胞結構,核膜破裂,核溶解的現(xiàn)象十分明顯,與此相反,ALR-shRNA組凋亡及壞死較少。3.Caspase 3活性測定顯示,經1.88μg/ml阿霉素處理24 h后,ALR-tx細胞caspase 3活性明顯升高,約為處理前的2.3倍,其余各組細胞的caspase活性則未見明顯變化;經過1.88μg/ml阿霉素處理48 h后,各組細胞caspase 3活性均出現(xiàn)明顯上升,其中ALR-tx細胞上升最為明顯,為處理前的3.3倍,ALR-shRNA細胞caspase 3活性為處理前的2.0倍,對照組細胞caspase 3活性為處理前的2.7倍。PARP剪切體含量測定顯示,經1.88μg/ml阿霉素處理24 h后,ALR-tx細胞PARP剪切體含量上升最為明顯,為處理前的2.5倍;處理48 h后,ALR-shRNA細胞PARP剪切體含量最少,為處理前的3.5倍,同時ALR-tx細胞PARP剪切體含量則為處理前的4.5倍。流式細胞技術分析顯示,阿霉素處理24 h后,Mock組細胞和Vector-tx組細胞的凋亡率分別增加了20.3%和11.5%,同時,ALR-tx組細胞的凋亡率增加了38.3%。阿霉素處理48 h后,Mock組細胞和Vector-tx細胞的凋亡率分別達到了32.7%和28.9%,ALR-tx組細胞的凋亡率則達到了39.4%。4.高內涵技術定量分析細胞內藥物含量顯示,在不同藥物劑量下,ALR-tx組細胞內阿霉素含量與Vector-tx細胞內熒相比明顯升高;而ALR-shRNA細胞內藥物含量明顯低于Vector-tx細胞。而在經過3μM維拉帕米預處理1 h后,各組細胞內阿霉素含量均有一定程度的升高。5.ALR-shRNA細胞ABCB1的mRNA水平為ALR-tx細胞的3倍;ABCG2水平為ALR-tx細胞的4倍;而ALR-tx細胞與ALR-shRNA細胞的ABCC1及ABCC10水平無明顯差異。Western blot結果顯示,ALR-tx細胞ABCB1蛋白表達量為Vector-tx細胞的60%,ABCG2蛋白表達量為Vector-tx細胞的65%;ALR-shRNA細胞ABCG2蛋白表達量為Vector-tx細胞的2.3倍。6.挽救實驗證實,向ALR-shRNA細胞中轉染ALR質粒后,可以看到ALR的蛋白表達量有了明顯上升;同時,ABCB1及ABCG2的蛋白表達量均較轉染前及轉染空載體組有所下降,其中ABCB1下降了39.7%,ABCG2下降了33.6%。激光共聚焦顯微鏡觀察細胞內阿霉素含量,可見當ALR-shRNA細胞轉染ALR質粒后,細胞內阿霉素含量明顯升高,而轉染空載體的細胞則沒有這種現(xiàn)象。高內涵分析顯示當ALR-shRNA細胞轉染表達ALR的質粒后,細胞內阿霉素含量約為轉染前的2倍。7.Western blot結果顯示,ALR-tx細胞Snail蛋白表達量為Mock細胞的80%,p-AKT T308位點磷酸化水平降低。ALR-shRNA細胞Snail蛋白表達量為Mock細胞的1.2倍,p-AKT T308位點及S473位點磷酸化水平升高。結論:于HCC中轉染ALR基因可以顯著抑制HCC細胞的耐藥性,其機制可能與ALR抑制AKT磷酸化及Snail活化,進而減弱ABCB1和ABCG2轉錄與翻譯,從而增加諸如阿霉素等抗癌藥在癌細胞滯留有關。本研究結果提示,ALR基因有可能成為提高HCC化療療效的潛在靶分子,用于改善HCC治療及其預后。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：首都醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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