本文關(guān)鍵詞： 氯化兩面針堿 肺癌 細(xì)胞凋亡 細(xì)胞周期 Wnt通路　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景和目的:由于環(huán)境及生活方式的改變,肺癌的發(fā)生率逐年升高,目前已成為全世界急需攻克的難題。大部分患者在就診時(shí)已處于進(jìn)展期,使肺癌的五年生存率處于低水平。因此,我們急切尋找更多治療肺癌的有效藥物。近幾年天然產(chǎn)品氯化兩面針堿被認(rèn)為具有抗腫瘤作用。已有多項(xiàng)實(shí)驗(yàn)證明氯化兩面針堿對乳腺癌、肝癌、結(jié)腸癌、前列腺癌等細(xì)胞具有抑制增殖作用,但尚未見對肺癌細(xì)胞作用的研究。本實(shí)驗(yàn)以肺癌A549細(xì)胞為研究對象,觀察氯化兩面針堿對其抑制作用并討論相關(guān)機(jī)制。1.觀察氯化兩面針堿對人肺癌細(xì)胞生長和增殖的影響;2.觀察氯化兩面針堿對人肺癌細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的影響,并探討其機(jī)制。方法:1.不同濃度的氯化兩面針堿作用于A549細(xì)胞,體外培養(yǎng)48h后,應(yīng)用MTT法檢測A549細(xì)胞的生長和增殖情況;2.不同濃度的氯化兩面針堿作用于A549細(xì)胞后,應(yīng)用Hoechst33258染色法觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)變化;應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞凋亡率,PI單染法檢測各組細(xì)胞周期比例;應(yīng)用Western blot方法檢測各組細(xì)胞凋亡通路、Wnt通路及細(xì)胞周期相關(guān)分子的表達(dá)情況。結(jié)果:1.MTT結(jié)果顯示,氯化兩面針堿顯著抑制A549細(xì)胞的增殖,其抑制增殖作用呈時(shí)間和劑量依賴性。單因素方差分析,各時(shí)間段內(nèi)實(shí)驗(yàn)組與對照組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(**P0.05,***P0.01);2.應(yīng)用Hoechst33258染色法,可見經(jīng)氯化兩面針堿處理過的A549細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)內(nèi)可見濃染致密的顆粒狀、塊狀熒光,形成大小不等、內(nèi)含細(xì)胞器和細(xì)胞核的凋亡小體;3.Annexin V-FITC/PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,不同濃度的氯化兩面針堿對A549細(xì)胞具有誘導(dǎo)凋亡作用,與對照組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(*P0.05,**P0.01);4.PI單染法結(jié)果顯示,經(jīng)氯化兩面針堿處理后的A549細(xì)胞,G2/M期細(xì)胞顯著增多,呈劑量依賴性,提示氯化兩面針堿具有阻滯細(xì)胞周期的作用;5.Western blot檢測結(jié)果顯示,隨著氯化兩面針堿濃度的升高,A549細(xì)胞的凋亡通路相關(guān)分子Bcl-xl、Bid、PARP、p-β-catenin的表達(dá)水平下調(diào);Cyto-C、β-catenin的表達(dá)水平上調(diào);Caspase-9、Caspase-3、Caspase-8活性增強(qiáng)。提示氯化兩面針堿能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡,呈劑量依賴性。細(xì)胞周期相關(guān)蛋白Cyclin D1表達(dá)水平逐漸下調(diào)。提示氯化兩面針堿可阻滯細(xì)胞周期,呈劑量依賴性。結(jié)論:1.氯化兩面針堿可抑制肺癌A549細(xì)胞的生長和增殖;2.氯化兩面針堿可通過線粒體通路和死亡受體通路誘導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡,可能有Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的參與,并受Bcl-2蛋白家族的調(diào)節(jié);3.氯化兩面針堿可阻滯肺癌A549細(xì)胞于G2/M期。
[Abstract]:Background and objective: the incidence of lung cancer has increased year by year due to changes in environment and lifestyle, and has become an urgent problem in the world. The five-year survival rate for lung cancer is low. We are eager to find more effective drugs for the treatment of lung cancer. In recent years, the natural product, dianethine chloride, has been considered to have an anti-tumor effect. There have been many experiments to prove that chlorinated nitidine is effective in breast cancer, liver cancer, colon cancer, and so on. Prostate cancer and other cells have inhibitory effect on proliferation, but no study has been done on lung cancer cell line A549. To observe the inhibitory effect of nitidine chloride on the growth and proliferation of human lung cancer cells and to discuss the related mechanism. 2. To observe the effect of nitidine chloride on apoptosis and cell cycle of human lung cancer cells. Methods 1. A549 cells were treated with different concentrations of nitidine chloride. After cultured for 48 hours, the growth and proliferation of A549 cells were detected by MTT assay. The morphological changes of apoptosis were observed by Hoechst33258 staining and the cell cycle ratio was detected by Annexin V-FITC / Pi double staining flow cytometry and Pi single staining. Western blot method was used to detect the expression of Wnt pathway and cell cycle related molecules in A549 cells. Results: 1. The results showed that the proliferation of A549 cells was significantly inhibited by A549. Univariate analysis of variance (ANOVA) showed that the difference between the experimental group and the control group was statistically significant. The Hoechst33258 staining method was used. It can be seen that the nucleus or cytoplasm of A549 treated with nitidine chloride can be seen in dense granular, massive fluorescence, and different size. 3. Annexin V-FITC / Pi double staining flow cytometry results showed that the A549 cells contained organelles and nuclear apoptotic bodies. The apoptosis of A549 cells was induced by different concentrations of nitidine chloride. Compared with the control group, the difference was statistically significant. 4. The results of Pi single staining showed that the number of G 2 / M phase cells in A549 cells treated with dianethine chloride was significantly higher than that in the control group. In a dose-dependent manner, it was suggested that nitidine chloride could block the cell cycle. 5. Western blot analysis showed that, With the increase of the concentration of nitidine chloride, the expression level of Bcl-xlbup- 尾 -catenin was down-regulated in A549 cells. The expression level of 尾 -catenin up-regulated the activity of Caspase-9, Caspase-3 and Caspase-8 in A549 cells, suggesting that nitidine chloride could induce apoptosis of A549 cells. The expression of cell cycle associated protein Cyclin D1 was down-regulated in a dose-dependent manner. Conclusion: 1. Dianethine chloride can inhibit the growth and proliferation of lung cancer A549 cells. The apoptosis of lung cancer A549 cells can be induced by nitidine chloride through mitochondrial pathway and death receptor pathway, which may be involved in Wnt/ 尾 -catenin signal transduction pathway. It was also regulated by Bcl-2 protein family. Nitidine chloride could block A549 cells in G _ 2 / M phase.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R734.2

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