發(fā)布時間：2018-02-26 02:28

  本文關(guān)鍵詞： Hiwi基因 人乳腺癌 細(xì)胞生長 基因干擾　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：乳腺癌是女性常見的惡性腫瘤之一,發(fā)生率逐年升高,并有年輕化趨勢。目前乳腺癌發(fā)病的病因及發(fā)病機(jī)制尚不完全清楚。Hiwi基因?qū)儆赑iwi蛋白家族一員，基因定位于12號染色體，編碼蛋白為98.5kd，在干細(xì)胞自我更新中發(fā)揮重要作用。最近研究表明, Hiwi基因在人口腔鱗狀上皮癌、人胰腺癌、人胃癌以及腸癌等組織中異常表達(dá)，并與這些腫瘤的預(yù)后密切相關(guān)，高水平Hiwi蛋白表達(dá)也與腫瘤的低分化、侵潤程度以及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。因此，Hiwi基因被認(rèn)為是與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)基因之一。而乳腺癌組織中Hiwi是否高表達(dá)，Hiwi是否影響著乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展,目前國內(nèi)外尚無相關(guān)研究。 本研究目的是通過檢測人乳腺癌組織以及乳腺癌細(xì)胞株中Hiwi基因及蛋白的表達(dá),通過在乳腺癌細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)Hiwi基因以及抑制Hiwi基因表達(dá)等研究方法評價Hiwi基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生長的影響，探討Hiwi基因與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展之間的關(guān)系。 一、Hiwi基因在乳腺癌組織及細(xì)胞內(nèi)高表達(dá)，與腫瘤的惡性程度有關(guān) 采集47例乳腺癌患者腫瘤組織及癌旁組織，體外培養(yǎng)MDA-MB-231、MCF-7與MCF-12A乳腺癌細(xì)胞系。提取腫瘤組織以及細(xì)胞系的總RNA，應(yīng)用實時定量PCR技術(shù)進(jìn)行Hiwi基因表達(dá)mRNA的檢測，其檢測結(jié)果進(jìn)行臨床病理學(xué)資料相關(guān)性研究；提取腫瘤組織以及細(xì)胞系的總蛋白，應(yīng)用Western blot進(jìn)行Hiwi基因表達(dá)蛋白檢測。 實時定量PCR結(jié)果顯示Hiwi基因mRNA在腫瘤組織樣本表達(dá)明顯高于癌旁組織樣本。Hiwi基因mRNA表達(dá)與乳腺癌患者年齡及更年期無關(guān)，但與患者腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分化有關(guān)。在大尺寸腫瘤、有腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移以及高分期的腫瘤組織內(nèi)呈現(xiàn)高表達(dá)。Western blot分析15例樣本的Hiwi基因蛋白表達(dá)，其結(jié)果顯示Hiwi基因蛋白在腫瘤組織樣本表達(dá)明顯高于癌旁組織樣本。與正常乳腺細(xì)胞相比，MDA-MB-231和MCF-7細(xì)胞內(nèi)Hiwi基因mRNA與蛋白呈高表達(dá)，二者相比具有顯著差異；而在MCF-12A細(xì)胞表達(dá)沒有差異性。綜上實驗結(jié)果證實了Hiwi基因在腫瘤組織與腫瘤細(xì)胞內(nèi)呈高表達(dá)。 二、Hiwi基因過表達(dá)促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞MCF-7生長 應(yīng)用脂質(zhì)體將質(zhì)粒載體pcDNA3.1（+）與Hiwi-2A-eGFP-pcDNA3.1（+）轉(zhuǎn)染入人乳腺癌細(xì)胞MCF-7，轉(zhuǎn)染細(xì)胞通過G418進(jìn)行穩(wěn)定篩選。應(yīng)用實時定量PCR與Western blot檢測Hiwi基因的表達(dá)，通過細(xì)胞計數(shù)8天內(nèi)細(xì)胞數(shù)目以及6天內(nèi)細(xì)胞克隆生成能力檢測，判定Hiwi基因過表達(dá)對MCF-7細(xì)胞生長的影響。 實時定量PCR檢測結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染Hiwi基因的不同代系乳腺癌細(xì)胞MCF-7其Hiwi mRNA的表達(dá)均高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）細(xì)胞，Western blot檢測結(jié)果顯示在轉(zhuǎn)染Hiwi基因的不同代系乳腺癌細(xì)胞MCF-7中Hiwi蛋白的表達(dá)呈高表達(dá)，均高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）細(xì)胞。 細(xì)胞計數(shù)在細(xì)胞接種后每隔1天完成共3次。結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Hiwi基因MCF-7細(xì)胞生長的速率明顯高于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）細(xì)胞，尤其在接種后的4-6天。細(xì)胞克隆實驗顯示轉(zhuǎn)染Hiwi基因MCF-7細(xì)胞克隆細(xì)胞形成數(shù)目明顯多于轉(zhuǎn)染pcDNA3.1（+）細(xì)胞。 綜上，我們實驗證實在乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)過表達(dá)Hiwi基因產(chǎn)物能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞生長。 三、通過siRNA抑制Hiwi基因表達(dá)能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞系生長 根據(jù)Hiwi基因序列設(shè)計靶向抑制該基因表達(dá)的siRNA序列，并在體外人工合成，通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入Hiwi基因高表達(dá)的MCF-7細(xì)胞，應(yīng)用實時定量PCR與Western blot檢測Hiwi基因表達(dá)，，通過細(xì)胞計數(shù)6天內(nèi)細(xì)胞數(shù)目以及6天內(nèi)細(xì)胞克隆生成能力檢測判定siRNA抑制Hiwi表達(dá)對MCF-7生長影響。 將靶向Hiwi基因siRNA應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞24小時后，應(yīng)用實時定量PCR以及轉(zhuǎn)染48小時后應(yīng)用Western blot進(jìn)行Hiwi基因表達(dá)檢測。其檢測結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染Hiwi siRNA的MCF-7細(xì)胞的Hiwi基因在mRNA以及蛋白水平表達(dá)受到抑制，與對照組相比明顯下降，二者相比具有統(tǒng)計學(xué)意義。 將靶向Hiwi基因siRNA應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入MCF-7細(xì)胞48小時后重新接種細(xì)胞，在不同時間段計數(shù)細(xì)胞，結(jié)果顯示在接種第4-6天，轉(zhuǎn)染siRNA的細(xì)胞生長受到抑制，與對照組相比具有顯著性差異。細(xì)胞克隆實驗顯示轉(zhuǎn)染siRNA的MCF-7細(xì)胞形成克隆細(xì)胞數(shù)明顯低于對照細(xì)胞。 綜上，通過siRNA抑制Hiwi表達(dá)能夠有效抑制乳腺癌細(xì)胞系生長。 本研究通過檢測Hiwi基因在乳腺癌組織以及乳腺癌細(xì)胞株內(nèi)的表達(dá)，證實其在乳腺癌中高表達(dá)。通過Hiwi基因在腫瘤細(xì)胞的過表達(dá)以及siRNA抑制Hiwi基因在腫瘤細(xì)胞內(nèi)表達(dá)兩個方面證實Hiwi基因?qū)θ橄侔┘?xì)胞生長的影響。說明Hiwi基因起到了癌基因作用，成為乳腺癌治療的新靶點。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

【參考文獻(xiàn)】

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1 傅建民;石劍;周頡;;乳腺癌血管內(nèi)皮生長因子C表達(dá)及其與臨床病理相關(guān)性研究[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報;2009年11期

2 馬寧;董曉燕;姜艷芳;劉蒙蒙;劉子玲;;利用Gateway克隆技術(shù)構(gòu)建人Hiwi腺病毒載體[J];吉林大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2014年04期

3 張紅麗;凌斌;馮定慶;;Piwi蛋白與基因的表達(dá)調(diào)控及其在腫瘤中的作用[J];國際婦產(chǎn)科學(xué)雜志;2014年05期

4 向陽;娜日蘇;梅佳;張家驊;;piRNA在癌癥上的研究進(jìn)展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年26期

5 孫彩萍;周國忠;王建芳;陳遐林;;胃癌患者化療前后T細(xì)胞亞群極化狀態(tài)的研究[J];海峽藥學(xué);2011年10期

6 周純武;李靜;;乳腺影像學(xué)2011年度進(jìn)展報告[J];中國繼續(xù)醫(yī)學(xué)教育;2011年08期

7 鄭剛;魏玲;左文述;;抑癌基因與乳腺癌的研究進(jìn)展[J];中華腫瘤防治雜志;2007年17期

8 趙琳琳;;青海地區(qū)藏、漢族乳腺癌組織中血管內(nèi)皮生長因子-C和環(huán)氧化酶-2的表達(dá)及其意義[J];青海醫(yī)藥雜志;2013年02期

9 陳取;田曉紅;柏樹令;;piRNA-PIWI通路作為腫瘤治療靶點研究進(jìn)展[J];中華腫瘤防治雜志;2013年23期

10 胡小輝;黃勝超;吳海濱;陳寶英;李建文;;Hiwi在乳腺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2014年24期

本文編號：1536173