本文關(guān)鍵詞： 彌漫型胃癌 lncRNA RP11-357H14.17 侵襲和轉(zhuǎn)移 EMT　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：【背景和目的】胃癌(gastric cancer,GC)是世界上最常見的惡性腫瘤之一,并且是亞洲地區(qū)引起癌性死亡的第二大病因。根據(jù)Lauren分型,胃癌分為彌漫型胃癌(diffuse-type gastric cancer,DGC)和腸型胃癌兩種胃癌類型;DGC也叫做低分化胃癌。雖然精準(zhǔn)醫(yī)療在臨床上大力拓展,但是仍缺乏可靠的早期預(yù)測標(biāo)志物及抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的治療靶點,DGC的發(fā)病率和死亡率反而逐年上升,5年生存率不到10%-20%,并且常見于年輕的病人。DGC因更強的侵襲性和轉(zhuǎn)移性使其成為預(yù)后最差的胃癌類型。已有大量研究證明許多致癌基因和抑癌基因參與到DGC的發(fā)生發(fā)展,但是其侵襲和轉(zhuǎn)移的具體作用機制卻不清楚。因此,針對DGC的侵襲和轉(zhuǎn)移分子機制探討,尋找潛在的早期診斷標(biāo)準(zhǔn)和治療靶點,對DGC患者具有十分重大的臨床意義。隨著高通量測序和新一代基因芯片技術(shù)的發(fā)展,長鏈非編碼RNA(long non-codingRNA,lncRNA)在基因組中發(fā)現(xiàn)存在著大量的轉(zhuǎn)錄。lncRNA不同于編碼基因,其是長度超過200個核苷酸序列但是沒有編碼蛋白的能力,通過在轉(zhuǎn)錄和轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達。近來研究表明lncRNA在細胞增殖、分化、凋亡和細胞周期等細胞調(diào)控中發(fā)揮著重要的作用。越來越多的研究發(fā)現(xiàn)lncRNA參與到腫瘤生物學(xué)功能的各個環(huán)節(jié),包括增殖、變異、細胞周期、侵襲和轉(zhuǎn)移等。這也使得異常表達的lncRNA在腫瘤的診斷和預(yù)后,藥物靶點的研究成為了熱點。然而,lncRNA在腫瘤中的作用機制仍然不清楚,尚處于早期研究階段。LncRNA RP11-357H14.17定位于17q21.32,在腫瘤中的作用國內(nèi)外尚未報道,所以對其在DGC中的功能及作用機制知之甚少。為了探討LncRNA RP11-357H14.17在DGC中的生物作用及侵襲轉(zhuǎn)移的機制,我們將本課題分為三個部分進行研究。首先通過高通量測序篩選并驗證LncRNA RP11-357H14.17在DGC中異常表達,其次結(jié)合臨床病理特征探討LncRNA RP11-357H14.17的臨床價值,再通過體內(nèi)外功能試驗探討LncRNA RP11-357H14.17對DGC生物學(xué)功能的影響,最后對其促進DGC侵襲和轉(zhuǎn)移機制進行初步的研究。第一部分彌漫型胃癌LncRNA的篩選及驗證【研究方法】1、臨床標(biāo)本選取,收集臨床診斷為低分化胃癌的6例患者癌組織及其癌旁正常胃粘膜標(biāo)本。2、采用高通量測序檢測分析6例彌漫型胃癌患者的癌組織和癌旁正常胃粘膜組織中l(wèi)ncrna的表達情況。3、分析測序中l(wèi)ncrna的表達情況,利用分層聚類分析篩選出明顯異常表達的lncrna。4、臨床接著選取符合條件的42例彌漫型胃癌患者進行qrt-pcr檢測,對lncrnarp11-357h14.17的表達水平進一步驗證。【結(jié)果】1、高通量測序結(jié)果顯示,將foldchange≥2且p-value0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn),在腫瘤組相對于正常組,共發(fā)現(xiàn)了112個差異表達的lncrna,其中73個lncrna表達上調(diào),39個lncrna表達下調(diào)。其中包括71個lincrna(18個下調(diào),53個上調(diào)),30個anti-senselncrna(16個下調(diào),14個上調(diào)),11個introniclncrna(5個下調(diào),6個上調(diào))。2、分層聚類法來分析高通量測序中異常表達的lncrna,篩選出明顯異常表達的10個lncrna。我們進一步將foldchange≥8且p-value0.05,并且將表達升高作為10個lncrna的篩選標(biāo)準(zhǔn),發(fā)現(xiàn)了xist,pvt1和rp11-357h14.17三個lncrna符合標(biāo)準(zhǔn),其中xist和pvt1已被報道在胃癌中高表達,這也證明了我們的測序結(jié)果和篩選標(biāo)準(zhǔn)的可靠性。隨后實驗我們將rp11-357h14.17作為研究對象。3、qrt-pcr檢測結(jié)果顯示在42例彌漫型胃癌患者中,lncrnarp11-357h14.17相對表達升高的有32個,相對表達降低的有10個。在對比正常胃粘膜組織中,lncrnarp11-357h14.17的表達水平明顯升高(p0.05)。qrt-pcr檢測結(jié)果和測序結(jié)果具有相同趨勢,為下一步rp11-357h14.17在彌漫型胃癌中的功能研究打下基礎(chǔ)。第二部分lncrnarp11-357h14.17病理學(xué)特征及對彌漫型胃癌生物學(xué)功能的探討【研究方法】1、結(jié)合臨床病理資料對lncrnarp11-357h14.17進行分析,分析其與彌漫型胃癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和tnm分期的相關(guān)性。2、利用qrt-pcr技術(shù)檢測lncrnarp11-357h14.17在5株胃癌細胞株(高分化ags、中分化sgc-7901、低分化mkn-45和mgc-803、正常胃粘膜ges-1)中的表達情況。3、利用si-rna技術(shù),制備和包裝si-rp11-357h14.17病毒,用si-rp11-357h14.17病毒轉(zhuǎn)染彌漫型胃癌細胞株mgc-803和mkn-45,下調(diào)lncrnarp11-357h14.17在細胞株中的表達。4、建立實驗分組,正常目的細胞組(con)、正常加陰性對照病毒感染的目的細胞組(nc)、正常加lncrna目的基因病毒感染的目的細胞組(kd)。5、mtt、克隆形成實驗檢測3組實驗細胞的增殖和生長情況。6、流式細胞儀檢測3組實驗細胞的細胞周期和凋亡率。7、劃痕實驗檢測、transwell小室實驗檢測3組實驗細胞的侵襲和遷移能力。8、裸鼠皮下荷瘤實驗檢測下調(diào)lncrnarp11-357h14.17對胃癌的影響�！窘Y(jié)果】1、在彌漫型胃癌患者中,胃癌組織中l(wèi)ncrnarp11-357h14.17的表達與患者的年齡、性別無明顯相關(guān)性(p0.05),而與腫瘤大小、浸潤深度、淋巴轉(zhuǎn)移和tnm分期相關(guān)(p0.05)。2、qrt-pcr技術(shù)檢測rp11-357h14.17在胃癌細胞株的表達結(jié)果顯示:rp11-357h14.17在胃癌細胞株mgc-803、mkn-45、sgc-7901、ags中的表達量明顯高于正常胃粘膜細胞株ges-1中表達量(p0.05)。差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。而在胃癌細胞株mgc-803、mkn-45、sgc-7901、ags相對于正常胃粘膜細胞株ges-1中mgc-803的表達量最高,mkn-45第二。而mgc-803和mkn-45屬于彌漫型胃癌細胞株,這就與rp11-357h14.17在彌漫型胃癌組織中高表達相符合。確定了我們研究的可行性和下一步研究的細胞株。3、成功制備和包裝si-rp11-357h14.17病毒,用si-rp11-357h14.17病毒轉(zhuǎn)染彌漫型胃癌細胞株mgc-803和mkn-45。通過qrt-pcr技術(shù)檢測mgc-803和mkn-45細胞中敲減效率,相對于對照組nc,si-rp11-357h14.17組lncrna基因敲減效率達到42.8%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。4、mtt結(jié)果顯示:正常加lncrna目的基因病毒感染的目的細胞組(kd)與對照組nc和正常目的細胞組con相比在加入mtt第4天對波長490nm的光的吸收率顯著降低,且隨時間變化,差異更明顯,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)�？寺⌒纬蓪嶒灲Y(jié)果表明:在mgc-803和mkn-45細胞中,sirna慢病毒感染12天后,相對于對照con和nc組,si-rp11-357h14.17組細胞克隆形成計數(shù)結(jié)果無明顯變化(p0.05),無統(tǒng)計學(xué)意義。5、流式細胞儀結(jié)果表明:細胞周期實驗中,相對于對照組nc,si-rp11-357h14.1組的rp11-357h14.17在s和g2/m期的細胞比例顯著升高,在g1期的細胞比例顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。細胞凋亡實驗中,在侵襲小室內(nèi)孵育24h后,相對于對照組con和nc組,si-rp11-357h14.17組中細胞轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。6、劃痕試驗結(jié)果顯示:在24小時時,si-rp11-357h14.17組中穿透膜的細胞數(shù)量與con組相比數(shù)量明顯減少,具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。侵襲實驗結(jié)果顯示:在侵襲小室內(nèi)孵育24h后,相對于對照組con和nc組,si-rp11-357h14.17組中細胞轉(zhuǎn)移的數(shù)量明顯降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.05)。7、裸鼠皮下荷瘤實驗檢測結(jié)果顯示:相對于空白對照組,si-RP11-357H14.17組腫瘤顯著縮小,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。第三部分LncRNA RP11-357H14.17促進彌漫型胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移的初步機制研究【研究方法】1、通過siRNA干擾技術(shù),用si-RP11-357H14.17病毒轉(zhuǎn)染彌漫型胃癌細胞株MGC-803和MKN-45,降低lncRNA RP11-357H14.17在細胞株MGC-803和MKN-45中的表達。2、建立實驗分組,正常目的細胞組(NC)和正常加lncRNA目的基因病毒感染的目的細胞組(KD)3、利用qRT-PCR技術(shù)檢測2組細胞中EMT的標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達情況。4、通過免疫印跡法(WB)檢測2組細胞中EMT的標(biāo)記物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表達情況。【結(jié)果】1、qRT-PCR技術(shù)檢測結(jié)果顯示:相對于對照組NC組,si-lncRNA組低表達的RP11-357H14.17在MGC-803和MKN45細胞株中E-cadherin和N-cadherin表達水平顯著升高,Vimentin的表達水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。2、免疫印跡法(WB)檢測結(jié)果顯示:相對于對照組NC組,si-lncRNA組低表達的RP11-357H14.17在MGC-803和MKN45細胞株中E-cadherin和N-cadherin表達水平顯著升高,Vimentin的表達水平顯著降低,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)�！窘Y(jié)論】1、通過測序及分層聚類分析篩選出在彌漫型胃癌中異常高表達的lncRNA RP11-357H14.17。LncRNA RP11-357H14.17在彌漫型胃癌組織中的表達水平明顯高于癌旁正常胃粘膜組織的表達量。2、體外下調(diào)胃癌細胞株中l(wèi)ncRNA RP11-357H14.17的表達顯示,RP11-357H14.17在彌漫型胃癌中能夠促進腫瘤細胞的增殖,影響胃癌細胞周期,抑制細胞凋亡,并促進細胞的侵襲和遷移。體內(nèi)實驗表明RP11-357H14.17能夠促進裸鼠種植腫瘤的生長。3、LncRNA RP11-357H14.17可能通過影響EMT來達到促進侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。4、LncRNA RP11-357H14.17在彌漫型胃癌中發(fā)揮致癌作用,有望成為彌漫型胃癌診斷和預(yù)后的標(biāo)記物,以及提供治療的有效靶點。
[Abstract]:In order to study the role of LncRNA RP11 - 357H14.17 in the diagnosis and prognosis of DGC , it is very important to find potential early diagnostic criteria and therapeutic targets . Methods The expression of lncrna in 6 patients with diffuse gastric cancer was analyzed by high - throughput sequencing . The expression of lncrna in normal gastric mucosa was analyzed by high - throughput sequencing . The expression of lncrna was screened by hierarchical clustering analysis . The expression level of lncrnarp11 - 357h14.17 increased significantly ( P < 0.05 ) . The results showed that the expression level of lncrnarp11 - 357h14.17 increased significantly ( P < 0.05 ) . cell cycle and apoptosis rate of 3 groups of experimental cells were detected by flow cytometry . The expression of lncrnarp11 - 357h14.17 in gastric cancer cell line mgc - 803 , mkn - 45 , sgc - 907h14.17 was significantly higher than that in normal gastric mucosa . The expression of E - cadherin , N - cadherin and vimentin was detected by Western blotting ( WB ) . The results showed that the levels of E - cadherin , N - cadherin and vimentin were significantly decreased in the control group ( P0.05 ) . In vivo experiments , the expression of lncRNA RP11 - 357H14.17 in diffuse gastric cancer was significantly higher than that of normal gastric mucosa . RP11 - 357H14.17 could promote the growth of tumor cells in nude mice .

【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

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本文編號：1532964