本文關鍵詞： TIGAR 自噬 氧化應激 放射敏感性　出處：《蘇州大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:干擾TP53誘導的糖酵解及凋亡調節(jié)蛋白(TIGAR)表達可以增加腫瘤細胞自噬活性,課題組前期工作表明干擾TIGAR表達可增加人腦膠質瘤細胞的放射敏感性,但其與自噬的相關性仍不明了。本課題通過改變TIGAR表達水平,研究受照膠質瘤細胞自噬水平對其存活作用,從而進一步闡述TIGAR調節(jié)膠質瘤細胞放射敏感性的機制。建立腦膠質瘤原位接種模型,通過慢病毒轉染,在動物體內研究干擾TIGAR表達對膠質瘤放療敏感性影響。最后,檢測TIGAR蛋白在惡性膠質瘤及瘤旁組織中表達,分析其在惡性膠質瘤中表達的臨床意義。方法:采用Western blot技術檢測8Gy 6MV-X線照射后A172及T98G膠質瘤細胞內TIGAR表達及磷酸化p53蛋白水平的變化;運用實時熒光定量PCR技術檢測電離輻射后A172細胞TIGAR轉錄水平的改變;分別通過轉染TIGAR siRNA干擾TIGAR表達,pcDNA3.1-TIGAR過表達TIGAR,通過克隆形成試驗檢測不同TIGAR表達水平細胞受照后的克隆形成能力;采用NADPH檢測試劑盒檢測不同TIGAR表達水平細胞照射前后細胞內的氧化還原水平;采用Western blot技術檢測改變TIGAR表達對細胞受照后自噬水平的影響;通過抑制受照細胞的自噬水平,觀察電離輻射誘導自噬在細胞存活中作用,在此基礎上探討電離輻射誘導的自噬發(fā)生的機制;通過原位種植膠質瘤細胞建立人腦膠質瘤裸鼠原位種植模型,采用TIGAR shRNA慢病毒實現(xiàn)基因治療,并利用核磁共振成像(MRI)技術評價基因治療聯(lián)合放療的治療效果,病理免疫組化觀察放療后腫瘤組織內TIGAR蛋白表達以及治療后病理反應;最后采用免疫組化技術檢測惡性膠質瘤中TIGAR表達水平,分析其與惡性膠質瘤的病理分級相關性,以及與患者放療療效、生存時間等臨床資料的相關性。結果:(1)電離輻射后,p53野生型人腦膠質瘤A172細胞內TIGAR表達水平在照后1 h開始增加,照后8 h回落至基礎水平;p53蛋白于照后0.5 h開始發(fā)生磷酸化,照后1 h達到峰值,而后緩慢下降。TIGAR mRNA水平受照后0.5 h開始增加,于受照后2 h達到峰值,而后開始回落,至受照后4-8 h回落至照前水平;而在受照后各時間點,TP53 mRNA水平均無顯著變化(*p0.05)。在受照的p53突變型(M237I)T98G細胞中,TIGAR水平無顯著變化�？寺⌒纬稍囼烇@示,干擾TIGAR表達顯著降低A172、T98G細胞受照后克隆形成率,相反TIGAR過表達則顯著增加了受照膠質瘤細胞的克隆形成能力。(2)干擾TIGAR表達導致受照細胞內NADPH水平耗竭,單純照射組細胞內NADPH的含量僅較照射前下降了40%,而TIGAR干擾聯(lián)合照射組細胞內NADPH的含量較照射前下降了約75%。相似的,干擾TIGAR表達也引起了受照膠質瘤細胞內GSH/GSSG比例較單純照射組明顯下降。(3)干擾TIGAR聯(lián)合電離輻射導致膠質瘤細胞損傷性自噬活性明顯增加,其與細胞ROS通路相關。(4)通過TIGAR shRNA慢病毒基因治療,證實了干擾TIGAR表達可增加荷瘤小鼠顱內膠質瘤的放療敏感性。(5)TIGAR蛋白主要在惡性膠質瘤組織中表達,而在瘤旁組織中無明顯表達,TIGAR表達與患者病理分級具有相關性,TIGAR表達可影響惡性膠質瘤患者放療近期療效。結論:本課題的研究創(chuàng)新性地提出干擾TIGAR表達可引起受照人腦膠質瘤細胞發(fā)生損傷性自噬,其機制可能與受照膠質瘤細胞氧化還原水平失衡相關。干擾TIGAR表達可在整體水平增加膠質瘤的放療敏感性。TIGAR表達可能參與了膠質瘤發(fā)生發(fā)展,對病理診斷以及預測放療近期療效有一定價值。
[Abstract]:Objective: to regulate protein interference TP53 induced glycolysis and apoptosis (TIGAR) can increase the expression of autophagy activity of tumor cells, the prophase showed that interfering TIGAR expression can increase the radiosensitivity of human glioma cells, but its correlation with autophagy remains unknown. This topic by changing the expression level of TIGAR, according to research by the role of autophagy in glioma cells survive on the mechanism to explain TIGAR regulating radiosensitivity of glioma cells. The establishment of brain glioma orthotopic model, through lentivirus transfection, in vivo animal studies the interference effect of TIGAR expression on the radiosensitivity of human glioma. Finally, detect the expression of TIGAR protein in malignant glioma and its'contiguous in the organization, the clinical significance of the expression in malignant glioma. Methods: using Western blot technology to detect 8Gy 6MV- X-ray irradiated A172 and T98G glioma cells TIGA The expression of R and phosphorylated p53 protein level in A172 cells; change the transcription level of TIGAR by real-time fluorescence quantitative PCR detection of ionizing radiation; were expressed by transfection of TIGAR siRNA interference TIGAR pcDNA3.1-TIGAR, overexpression of TIGAR by clonogenic assay and TIGAR expression level of different clone cells after irradiation formation was detected by NADPH; kit for detecting TIGAR expression level of cells before and after irradiation with different intracellular redox levels; using Western blot technology to detect the change of TIGAR expression on the effects of autophagy induced by irradiation; through inhibition of autophagy by cells, induces autophagy in cell survival observed in ionizing radiation, on the basis of mechanism induced by ionizing radiation the occurrence of autophagy; through orthotopic glioma cells established in situ glioma xenograft model, using TIGAR shRNA Lentiviral gene therapy, and the use of magnetic resonance imaging (MRI) technique to evaluate gene therapy combined with radiotherapy treatment, immunohistochemical observation after radiotherapy TIGAR protein expression in tumor tissue and pathological response after treatment; the immunohistochemical detection of malignant glioma and to analyze the expression levels of TIGAR in malignant glioma the correlation between tumor pathological grading, and radiotherapy effect, the correlation of clinical data and survival time. Results: (1) after irradiation, the expression level of H began to increase after 1 in the TIGAR p53 wild type human glioma A172 cells after exposure to 8 h down to the basic level of p53 protein in 0.5 after irradiation; the beginning of H phosphorylation at 1 h reached the peak, and then slowly decreased.TIGAR mRNA levels after exposure to 0.5 h began to increase after exposure to 2 h reached the peak, and then began to fall, after exposure to 4-8 h down to the water before irradiation Ping; after exposure in each time point, the TP53 mRNA level had no significant changes (*p0.05). In the irradiated p53 mutant (M237I) in T98G cells, no significant changes in TIGAR levels. Colony formation test showed that the interference of TIGAR expression significantly decreased A172, T98G cells after exposure to clone formation rate, on the contrary over expression of TIGAR was significantly increased by glioma cells clone forming ability. (2) the expression of TIGAR by NADPH interference leads to depletion of intracellular levels, the content of the irradiated group of intracellular NADPH is only before irradiation decreased by 40%, while the content of TIGAR interference combined with radiation group NADPH cells than before irradiation decreased about 75%. similar, interfering TIGAR expression also caused by glioma cells in GSH/GSSG proportion compared with irradiation group decreased significantly. (3) TIGAR interference combined with ionizing radiation leads to injury of glial tumor cell autophagy activity was significantly increased, and the cells of ROS pathway. (4) by TIGAR shRNA lentiviral gene therapy, confirmed that the interference of TIGAR expression can increase the radiosensitivity of intracranial glioma bearing mice. (5) TIGAR protein mainly expressed in malignant glioma tissues, and in tumor adjacent tissue and no obvious expression, the relationship between the expression of TIGAR in patients with pathological grading, TIGAR expression the short-term effects of radiotherapy in patients with malignant glioma. Conclusion: the innovation of this research put forward the interference of TIGAR expression induced by irradiation of glioma cell injury of autophagy, and its mechanism may be exposed to oxidation of glioma cells is imbalance. Primary interference TIGAR expression can increase the radiosensitivity of.TIGAR glioma expression participate in the development of glioma in the overall level, have a certain value for diagnosis and prediction of the short-term efficacy of radiotherapy.

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41;R730.55

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