發(fā)布時間：2018-02-24 16:13

  本文關(guān)鍵詞： microRNA miR-193a-3p 前列腺癌 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 CyclinD1　出處：《浙江大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：前列腺癌是男性人群中最常見的腫瘤之一。根據(jù)國家癌癥中心的最新數(shù)據(jù),前列腺癌自2008年起稱為泌尿系統(tǒng)中發(fā)病率最高的腫瘤,在男性惡性腫瘤發(fā)病率排名中居第6位。然而,目前我們對于前列腺癌發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)機(jī)制缺乏更為深入的了解。除了常見的流行病學(xué)和遺傳學(xué)因素,許多錯綜復(fù)雜的分子事件是導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞形成、進(jìn)展和轉(zhuǎn)移的深層次原因。microRNA(又稱為miRNA)是小分子(長度約22nt)的非編碼RNA,它在諸多生物信號通路中都具備至關(guān)重要的調(diào)控作用。異常表達(dá)的microRNA常常與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。已有諸多研究表明前列腺癌與miRNA表達(dá)譜異常密切相關(guān)。 目的：本研究首先利用定量PCR技術(shù)考察miR-193a-3p在兩種不同的前列腺癌細(xì)胞株(DU-145,PC3)中的表達(dá)情況,并以細(xì)胞功能實驗展示了轉(zhuǎn)染miR-193a-3p對前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能的影響。隨后根據(jù)生物信息學(xué)知識,篩查潛在的miR-193a-3p作用靶點進(jìn)行驗證,最后通過靶基因分子的沉默和過表達(dá)實驗,證實]miR-193a-3p對靶基因的調(diào)控意義。 方法：1.比較前列腺癌細(xì)胞株(DU-145, PC3)中與正常前列腺上皮細(xì)胞(RWPE-1)中miR-193a-3p的表達(dá)是否存在差異； 2.通過體外轉(zhuǎn)染miR-193a-3p模擬體的方式使細(xì)胞進(jìn)入miR-193a-3p過表達(dá)狀態(tài),在此基礎(chǔ)上,通過細(xì)胞活力分析實驗(CCK-8)、流式細(xì)胞周期檢測、平板克隆形成,研究miR-193a-3p與前列腺癌細(xì)胞的何種功能有關(guān)； 3.利用生物信息學(xué)工具(TargetScan),預(yù)測miR-193a-3p的靶基因。并且通過定量PCR技術(shù),Western Blot技術(shù)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平及翻譯水平的驗證。與此同時進(jìn)行熒光素酶雙報告系統(tǒng)對miR-193a-3p的作用序列進(jìn)行進(jìn)一步的鑒定。以及使用RNA干擾、質(zhì)粒過表達(dá)實驗驗證miR-193a-3p與靶基因的調(diào)控關(guān)系。 結(jié)果：1.在前列腺癌細(xì)胞株中,miR-193-3p呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài),其中DU-145中miR-193a-3p的含量是RWPE-1的46.3%,在PC3中這個比例是19.0%； 2.通過對DU-145及PC3細(xì)胞株轉(zhuǎn)染(?)niR-193a-3p模擬體獲得miR-193a-3p過表達(dá)狀態(tài)。首先我們可以觀察到細(xì)胞的活力明顯受到了抑制。PC3細(xì)胞株中,25nM濃度的mniR-193a-3p轉(zhuǎn)染會使細(xì)胞活力下降13%(轉(zhuǎn)染后48小時)和24%(轉(zhuǎn)染后72小時)。DU-145細(xì)胞株中25nM的模擬體轉(zhuǎn)染可使細(xì)胞活力下降17%(48小時)和63%(72小時)。流式細(xì)胞技術(shù)顯示miR-193a-3p模擬體可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的G1期阻滯。DU-145和PC3的G1期細(xì)胞百分比與對照組(NC)相比分別為77.36%對54.89%(p0.05),81.57%對61.80%(p0.05)。克隆形成實驗中,miR-193a-3p同樣會抑制細(xì)胞的集落形成。DU-145和PC3細(xì)胞株在轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后的克隆形成率分別為59.1%(p0.05)和31.6%(p0.05)。 3.根據(jù)生物信息學(xué)工具的預(yù)測,miR-193a-3p的靶基因可能為Cyclin D1,MMP-9, CADM1等。根據(jù)定量PCR的驗證結(jié)果,Cyclin D1在DU-145及PC3細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-193a-3p后出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄水平明顯下調(diào),而MMP-9和CADM-1并未顯示出如此趨勢。進(jìn)一步的熒光素酶雙報告系統(tǒng)實驗確認(rèn)了Cyclin D1是miR-193a-3p的直接作用靶點。對Cyclin D1的特異性沉默和過表達(dá)Rescue實驗進(jìn)一步證實了它在細(xì)胞周期及增殖過程中的作用。 結(jié)論：1.miR-193a-3p在前列腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)； 2.細(xì)胞內(nèi)過表達(dá)miR-193a-3p可使前列腺癌細(xì)胞DU-145和PC3出現(xiàn)G1期阻滯,抑制細(xì)胞增殖； 3. Cyclin D1是miR-193a-3p的靶基因,通過抑制Cyclin D1的表達(dá),miR-193a-3p可以將細(xì)胞周期阻滯在G1期,進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R737.25

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓蘇軍;張思維;陳萬青;李長嶺;;中國前列腺癌發(fā)病現(xiàn)狀和流行趨勢分析[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2013年04期

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本文編號：1530875