本文關鍵詞： 胃癌 轉移 miR-214 CREB1 CSF1　出處：《山東大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：胃癌是我國及世界上最常見的惡性腫瘤之一,胃癌患者的預后較差。浸潤轉移是胃癌的一個重要特征,常導致患者預后不良。揭示胃癌浸潤轉移的分子機制是胃癌基礎和臨床研究的重要課題。除了基因學的改變以外,非編碼RNA特別是microRNA(miRNA,miR),對腫瘤的發(fā)生發(fā)展、浸潤轉移也發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。miRNA是一類內(nèi)生性的、長度約19-25個核苷酸的小RNA,主要是通過與靶基因mRNA的3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)結合,降解靶mRNA或抑制靶蛋白的翻譯,廣泛參與增殖、凋亡、發(fā)育、分化等多種生物學過程,在人類疾病包括腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。而目前尚未見miR-214在胃癌中的詳細研究。本研究擬在人胃癌組織及細胞系中檢測miR-214的表達情況,進行miR-214功能學實驗以探究其生物學作用,并鑒定其調(diào)控的靶基因。預測軟件提示cAMP responsive element binding protein 1(CREB1,cAMP 反應元件結合蛋白)可能是miR-214的一個靶基因,本課題擬初步探究CREB1在胃癌中的表達、功能及分子機制,以期為胃癌的診斷和治療提供新的方法和靶點。第一部分胃癌中miR-214表達的臨床意義及其對胃癌細胞生物學行為的影響研究目的:1.檢測miR-214在胃癌組織及細胞中的表達情況。2.分析miR-214與臨床病理參數(shù)及患者預后的關系。3.探究miR-214對胃癌細胞浸潤轉移及增殖、凋亡的影響。4.鑒定miR-214直接調(diào)控的靶基因。研究方法:1.使用實時定量PCR檢測80例胃癌組織和18例非腫瘤胃黏膜組織及4種胃癌細胞株(MKN28、BGC823、MKN45及SGC7901)、1種非腫瘤的永生化細胞株GES-1中miR-214的表達情況。2.收集患者臨床資料及隨訪信息,分析miR-214與腫瘤直徑、淋巴結轉移等臨床病理參數(shù)的關系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析miR-214的預后價值。3.胃癌細胞轉染LV3-hsa-miR-214(過表達)、miR-214 inhibitor(抑制劑)及Negativecontrol(陰性對照)后,進行細胞遷移浸潤和增殖、凋亡實驗來驗證其生物學功能。4.使用TargetScan軟件預測miR-214的靶基因,通過熒光素酶檢測和Western blot實驗,驗證miR-214調(diào)控的直接靶基因。結果:1.80例胃癌組織中miR-214的表達水平較18例非腫瘤胃黏膜組織下調(diào)約6倍,在有淋巴結轉移的胃癌組織中下調(diào)更明顯。同時,4種胃癌細胞中miR-214的表達水平較非腫瘤胃粘膜組織也呈現(xiàn)不同程度的下調(diào)。2.miR-214的表達與腫瘤直徑及淋巴結轉移呈負相關。然而生存分析顯示miR-214對患者的預后無明顯影響。3.miR-214可抑制胃癌細胞的增殖、遷移浸潤能力,而對細胞凋亡無明顯作用。4.靶基因軟件 TargetScan 預測提示 FGFR1、CSF1、NOTCH2、CREB1、AGAP2等是miR-214的潛在靶基因。熒光素酶實驗和Western blot證實CSF1是miR-214的直接靶基因。結論及意義:miR-214在胃癌組織和多種胃癌細胞系中表達下調(diào),在轉移性的胃癌組織中降低更明顯。miR-214可抑制胃癌細胞的增殖、遷移浸潤能力,而對細胞凋亡無明顯影響。CSF1是miR-214的直接靶基因。miR-214對其它靶基因(如CREB1等)的調(diào)控作用有待進一步驗證。miR-214可下調(diào)CSF1的表達,miR-214可能通過調(diào)控CSF1發(fā)揮了抑制胃癌細胞增殖、遷移浸潤的作用。第二部分胃癌中CREB1的表達、預后價值及miRNA對其的調(diào)控作用研究目的:1.檢測CREB1在胃癌組織中的表達情況。2.分析CREB1在胃癌中的臨床意義及預后價值。3.驗證CREB1是否受到miR-214等miRNA的調(diào)節(jié)。研究方法:1.免疫組化檢測185例原發(fā)灶胃癌組織、50例淋巴結轉移灶胃癌組織、50例非腫瘤胃粘膜組織中CREB1蛋白的表達情況。2.使用卡方檢驗分析CREB1表達與臨床病理參數(shù)的關系。Kaplan-Meier法及Log-rank檢驗分析CREB1表達與病人預后的關系。3.使用miRWalk、starBase軟件預測可能調(diào)控CREB1的miRNA,通過熒光素酶實驗、Western blot驗證miRNA對CREB1的調(diào)控作用。結果:1.CREB1在非腫瘤胃粘膜組織、胃癌原發(fā)灶、淋巴結轉移灶中呈遞增式表達。CREB1表達水平在有淋巴結轉移的組織相比于無淋巴結轉移的組織中明顯升高。2.CREB1的高表達與淋巴結轉移、遠處轉移、腫瘤分期正相關。3.CREB1高表達的患者的總生存時間和無瘤生存時間明顯短于CREB1低表達的患者。CREB1與腫瘤分期聯(lián)合構建的模型,是一個獨立的預后因子。4.CREB1 是 miR-27b 和 miR-200b 的直接靶基因,受到 miR-27b 和 miR-200b 的負向調(diào)控。結論及意義:CREB1的高表達與胃癌淋巴結轉移、腫瘤分期和患者預后不良相關。miR-27b和miR-200b可負向調(diào)節(jié)CREB1的表達。CREB1是一個有價值的生物標記物,對胃癌淋巴結轉移、病人預后有重要提示作用。miR-27b/200b-CREB1信號通路可能為胃癌的治療提供新的靶點。第三部分CREB1在胃癌中的功能及作用機制初探研究目的:1.探究CREB1在胃癌中的生物學功能。2.鑒定轉錄因子CREB1的下游靶基因,初步探討CREB1的作用機制。研究方法:1.在胃癌細胞中過表達CREB1或干擾CREB1的表達,檢測其對細胞增殖、遷移浸潤能力的影響。2.在胃癌細胞中,利用染色質(zhì)免疫共沉淀測序(Chromatin immunoprecipitation sequencing,ChIP-seq)分析轉錄因子CREB1在全基因組的結合譜,篩選CREB1可能調(diào)控的 mRNA、miRNA、lncRNA。3.在細胞轉染CREB1過表達質(zhì)粒或CREB1干擾RNA之后,使用實時定量PCR檢測CREB1下游候選lncRNA的表達水平。4.使用ChIP-qPCR(染色質(zhì)免疫共沉淀-實時定量PCR)證實CREB1與lncRNA啟動子的結合。結果:1.過表達CREB1能夠促進胃癌細胞的增殖、遷移浸潤;反之,下調(diào)CREB1表達則抑制胃癌細胞的增殖、遷移浸潤。2.ChIP-seq結果提示CREB1 可以結合到831 個mRNA、276個IncRNA、62個miRNA的啟動子區(qū)。3.ChIP-seq的結果與本課題組前期做的胃癌轉移相關IncRNA芯片取交集,將候選IncRNA范圍縮減為9個。4.通過實時定量PCR驗證,發(fā)現(xiàn)CREB1可正向調(diào)節(jié)lncRNALOC100270746、PIN1P1 及 ZEB1-AS1 的表達。5.ChIP-qPCR結果顯示CREB1在lncRNA的啟動子區(qū)有顯著富集。結論及意義:CREB1能夠促進胃癌細胞的增殖、遷移浸潤。LncRNA LOC100270746、PIN1P1及ZEB1-AS1的表達受到CREB1的正向調(diào)控。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.2

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 Chenggang Wang;Ren Ren;Haolin Hu;Changjun Tan;Miao Han;Xiaolin Wang;Yun Zheng;;MiR-182 is up-regulated and targeting Cebpa in hepatocellular carcinoma[J];Chinese Journal of Cancer Research;2014年01期

2 Jian Yao;Lin-hui Liang;Yu Zhang;Jie Ding;Qi Tian;Jin-jun Li;Xiang-huo He;;GNAI1 Suppresses Tumor Cell Migration and Invasion and is Post-Transcriptionally Regulated by Mir-320a/c/d in Hepatocellular Carcinoma[J];Cancer Biology & Medicine;2012年04期

，

本文編號：1525664