本文關(guān)鍵詞： miR-574 TGF-β1/Smad4 HIF-1α 正反饋調(diào)控 血管生成　出處：《吉林大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：Micro RNAs(mi RNAs)是一類約為22個(gè)核苷酸的內(nèi)源性非編碼單鏈RNA。在細(xì)胞核中RNA聚合酶Ⅱ以基因組DNA為模板轉(zhuǎn)錄形成初始mi RNAs(primi RNAs),經(jīng)核糖核酸酶Drosha切割形成長(zhǎng)度約70個(gè)核苷酸的具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的前體mi RNAs(pre-mi RNAs),前體mi RNAs通過Exportion5/Ran-GTP轉(zhuǎn)運(yùn)出核,在細(xì)胞質(zhì)中被核糖核酸酶Dicer切割并形成mi RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(mi RISC)。通過與靶基因m RNA的3’非翻譯區(qū)(3’UTR)結(jié)合,降解m RNA或阻遏蛋白翻譯。研究表明mi RNAs參與調(diào)控細(xì)胞生長(zhǎng)、發(fā)育、代謝及凋亡等許多生理過程,且在多種疾病中表達(dá)異常,和疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。血管是機(jī)體不可或缺的物質(zhì)基礎(chǔ),其主要功能是輸送氧氣和人體必需物質(zhì)。血管生成是一個(gè)多基因參與的復(fù)雜過程,在腫瘤發(fā)展中具有重要的作用。研究表明mi RNAs作為轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子參與了血管生成的調(diào)控。Mi R-574基因定位于4號(hào)染色體短臂4p14,編碼兩種成熟的mi RNAs:mi R-574-3p和mi R-574-5p�，F(xiàn)有的研究顯示mi R-574-3p具有抑癌作用,而mi R-574-5p則具有促癌作用。目前,調(diào)控mi R-574表達(dá)的分子機(jī)制仍不明確,亦無證據(jù)表明mi R-574參與了血管生成。在本論文中,我們研究了轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)和缺氧誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞中mi R-574表達(dá)的分子機(jī)制,同時(shí)研究了mi R-574對(duì)血管生成的作用和分子機(jī)制。我們首先研究了TGF-β1對(duì)胃癌細(xì)胞AGS中mi R-574表達(dá)的影響。QRT-PCR結(jié)果顯示TGF-β1上調(diào)了AGS細(xì)胞中pri-mi R-574和mi R-574-3p的表達(dá),但對(duì)mi R-574-5p的表達(dá)沒有影響。TGF-βⅠ型受體抑制劑SB431542和沉默Smad4能夠阻斷TGF-β1誘導(dǎo)的mi R-574-3p表達(dá)上調(diào)。我們預(yù)測(cè)了mi R-574基因的啟動(dòng)子序列,發(fā)現(xiàn)其位于mi R-574基因上游1kb片段內(nèi),且包含四個(gè)潛在的Smads結(jié)合位點(diǎn)。雙熒光素酶報(bào)告分析顯示,TGF-β1增加了mi R-574基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,而沉默Smad4抑制了TGF-β1誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄活性。染色質(zhì)免疫沉淀(Ch IP)證實(shí),Smad4能夠與mi R-574基因啟動(dòng)子直接結(jié)合,而Smad3則無此作用。MTT實(shí)驗(yàn)證明TGF-β1通過上調(diào)mi R-574-3p的表達(dá)來發(fā)揮其細(xì)胞增殖抑制作用,mi R-574-3p抑制劑部分緩解了TGF-β1誘導(dǎo)的AGS細(xì)胞增殖抑制。其次,我們發(fā)現(xiàn)缺氧能誘導(dǎo)mi R-574表達(dá)。在物理缺氧(2%O2)和化學(xué)缺氧(Co Cl2)下,胃癌細(xì)胞AGS、SGC-7901和宮頸癌細(xì)胞Hela以及293T細(xì)胞中mi R-574-3p和mi R-574-5p表達(dá)都上調(diào)。在293T細(xì)胞中過表達(dá)穩(wěn)定存在的突變型HIF-1α同樣上調(diào)了mi R-574-3p和mi R-574-5p的表達(dá)。HIF-1α抑制劑2-Me OE2和沉默HIF-1α均能顯著抑制缺氧下SGC-7901細(xì)胞中mi R-574-3p的表達(dá)。對(duì)mi R-574基因的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其包含四個(gè)潛在的缺氧反應(yīng)元件。雙熒光素酶報(bào)告分析顯示,HIF-1α能激活mi R-574基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性。Ch IP實(shí)驗(yàn)證實(shí),HIF-1α能夠與mi R-574基因啟動(dòng)子直接結(jié)合。此外,我們構(gòu)建了mi R-574表達(dá)載體p EGFP(C1)-574。過表達(dá)mi R-574能穩(wěn)定AGS細(xì)胞中HIF-1α。在穩(wěn)定表達(dá)mi R-574的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株SGC/p EGFP(C1)-574中HIF-1α蛋白也增加。向SGC/p EGFP(C1)-574細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染mi R-574-3p和mi R-574-5p抑制劑,結(jié)果表明mi R-574引起HIF-1α蛋白水平增加與mi R-574-3p相關(guān),而與mi R-574-5p無關(guān)。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)CUL2 m RNA的3’UTR區(qū)有mi R-574-3p的結(jié)合位點(diǎn),可能是mi R-574-3p的靶基因。雙熒光素酶報(bào)告分析證實(shí)了這一推測(cè)。免疫共沉淀結(jié)果顯示,過表達(dá)mi R-574通過抑制CUL2破壞了E3-泛素連接酶復(fù)合體的形成。在SGC/p EGFP(C1)-574細(xì)胞中,HIF-1α的蛋白水平增加,但HIF-1β表達(dá)無明顯變化;免疫熒光結(jié)果顯示細(xì)胞中HIF-1α和HIF-1β主要分布在細(xì)胞核中。抑制SGC/p EGFP(C1)-574細(xì)胞中HIF-1α的入核,部分降低了mi R-574-3p的表達(dá);且mi R-574-3p引起的HIF-1α蛋白增加能夠激活mi R-574基因啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄活性,表明二者間存在正反饋調(diào)控環(huán)路。最后,我們研究了mi R-574對(duì)血管生成的影響。在SGC/p EGFP(C1)-574細(xì)胞中VEGF m RNA和蛋白表達(dá)顯著增加,其培養(yǎng)液能促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的增殖、遷移、浸潤(rùn)和小管的形成。抑制SGC/p EGFP(C1)-574細(xì)胞中mi R-574-3p的表達(dá),顯著減少了HIF-1α和VEGF蛋白表達(dá),抑制了HUVEC細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)和小管的形成。抑制SGC/p EGFP(C1)-574細(xì)胞中mi R-574-5p的表達(dá),只減少了VEGF的表達(dá),同時(shí)抑制了HUVEC細(xì)胞增殖、遷移、浸潤(rùn)和小管的形成。另外我們發(fā)現(xiàn)mi R-574-5p能激活胃癌細(xì)胞中MAPK信號(hào)通路。我們揭示了胃癌細(xì)胞AGS中TGF-β1/Smad4信號(hào)通路調(diào)控mi R-574-3p表達(dá)的機(jī)制,以及缺氧通過HIF-1α上調(diào)mi R-574-3p和mi R-574-5p的表達(dá)。Mi R-574-3p通過靶向CUL2穩(wěn)定細(xì)胞中HIF-1α水平,而mi R-574-5p通過激活MAPK信號(hào)通路增強(qiáng)HIF-1α轉(zhuǎn)錄活性,形成一個(gè)正反饋調(diào)控環(huán)路;最后mi R-574能夠上調(diào)VEGF表達(dá)來促進(jìn)血管生成,分別抑制mi R-574-3p和mi R-574-5p都能引起VEGF表達(dá)降低并減少血管生成。本研究對(duì)生長(zhǎng)和發(fā)育中血管的生成、組織創(chuàng)傷愈合、心腦血管阻塞后血管再生,以及腫瘤組織血管生成等生理或病理過程具有重要意義。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R735.2

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6 丁s，

本文編號(hào)：1523596