本文關鍵詞： TSSC3 Nanog 骨肉瘤干細胞 Notch 內(nèi)皮細胞　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：骨肉瘤是常見的青少年骨原發(fā)惡性腫瘤之一,惡性程度高,易復發(fā)和轉移。骨肉瘤的轉移多發(fā)生于早期,80%~90%的患者就診時已存在臨床上不能發(fā)現(xiàn)的轉移灶。近年來骨肉瘤的長期生存率并沒有明顯提高,骨肉瘤的治療效果仍處于“瓶頸期”,骨肉瘤細胞對化療的敏感性差以及極強的復發(fā)性是臨床和基礎研究亟待解決的問題。而隨著骨肉瘤干細胞(osteosarcoma stem cell,OSC)的發(fā)現(xiàn)和證明,靶向OSC被認為提供了治療骨肉瘤的新方向。骨肉瘤是血管極為豐富的腫瘤,在青少年高發(fā),且治療效果并不十分令人滿意,手術和放化療結果并不能很好的控制病情發(fā)展,預后很差。因此,通過腫瘤干細胞方向?qū)侨饬鲞M行深入研究對于改善預后很有必要。CSC自我更新調(diào)控機制的研究是“刪除”CSC的切入點。印跡基因TSSC3(tumor-suppressing STF c DNA 3)又名PHLDA2,已被我們課題組證明了其抑癌基因的作用,進一步的研究發(fā)現(xiàn)其與OSC自我更新可能相關;過表達TSSC3可以抑制OSCs的干性轉錄因子OCT4、SOX2及Nanog的表達,其中以Nanog轉錄因子表達下降最明顯,但Nanog在骨肉瘤中的作用及其調(diào)控機制尚不明確。Nanog作為干性相關核轉錄因子,其在多種CSC中都發(fā)現(xiàn)和自我更新能力密切相關;Notch通路是重要的生長、分化調(diào)控相關的信號通路,在多種CSC中已被證明其激活和自我更新相關,并且有文獻報道在骨肉瘤和膠質(zhì)瘤細胞中都存在Notch通路關鍵分子的上調(diào),但在OSC中的作用及分子機制尚不清楚。已有研究發(fā)現(xiàn),胰腺癌中Notch1的合成和活化可能受到Src活性的影響,而TSSC3已被證明可以強烈抑制Src活性,因此TSSC3可能通過Src分子與Notch通路產(chǎn)生聯(lián)系,共同影響OSC的干性特征。腫瘤干細胞血管微環(huán)境(Perivascular niche)可能包括定位于血管內(nèi)皮細胞旁的CSC、血管內(nèi)皮細胞、信號通路相關分子、免疫細胞、成纖維細胞等。骨肉瘤是極富血管的惡性腫瘤,是研究腫瘤干細胞血管微環(huán)境的很好的模型。血管微環(huán)境已被發(fā)現(xiàn)在GSC(膠質(zhì)瘤干細胞)自我更新調(diào)控中起到重要作用,其中內(nèi)皮細胞是GSC血管微環(huán)境的重要組成部分。以往研究證明內(nèi)皮細胞可以增強GSC自我更新能力,為了發(fā)展靶向OSC的新治療方法,內(nèi)皮細胞影響OSC的自我更新的分子機制也非常值得研究。因此,本文重點探索了TSSC3基因、Notch通路及血管內(nèi)皮細胞對OSC自我更新能力的影響和機制。本文采用體外基因過表達和敲低技術、PCR、Western-blot、皮下移植瘤和顱內(nèi)移植瘤模型、臨床病理資料分析、免疫組化、免疫熒光、流式細胞術、Transwell雙室共培養(yǎng)等實驗技術方法,分別在第一部分研究了印跡基因TSSC3、Nanog在維持OSC干性表型中的作用,并在第二部分初步篩選了Notch通路眾多相關分子中有可能影響OSC的配體和受體,以及在內(nèi)皮細胞微環(huán)境中的作用。主要的實驗內(nèi)容及實驗結果和結論如下:一、TSSC3可通過Src/Akt抑制Nanog表達并抑制OSC干性表型1.TSSC3可以抑制OSC干性表型通過免疫組化方法、RT-PCR、Western-blot方法、成球培養(yǎng)方法、流式細胞術等實驗方法得到以下結果:1.1高表達TSSC3的患者預后在總生存期(OS)和無病生存期(PFS)都遠好于低表達TSSC3的患者(P0.05);TSSC3基因具有提示腫瘤復發(fā)潛能的作用,在復發(fā)VS未復發(fā)的病人中陽性比例是1/15 VS 9/26,P0.05。1.2利用成球培養(yǎng)的方法富集不同骨肉瘤細胞株(MTH、Sao S2)的OSC,干性相關核蛋白(Nanog、Sox2、Oct4)表達的升高;且在OSC中TSSC3表達明顯降低。1.3通過在不同骨肉瘤細胞系中建立TSSC3過表達模型,檢測到過表達TSSC3后Nanog的表達顯著降低,同時骨肉瘤細胞系的體外成球能力和成球體積都有明顯下降(MTH細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.44±0.09個細胞球VS 0.23±0.02個,P0.05;Sa OS2細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.42±0.18個細胞球VS0.34±0.07個,P0.05),干性表面標記CD133、CD117、Stro1表達也明顯下降(P0.05)。2.過表達Nanog可以增強OSC干性表型通過免疫組化方法、成球培養(yǎng)方法、流式細胞術、裸鼠成瘤能力實驗、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗、化療抵抗實驗等方法得到以下結果:2.1高表達Nanog和發(fā)生轉移的骨肉瘤患者有強相關性,在發(fā)生轉移VS未發(fā)生轉移的患者中Nanog的陽性表達比例為7/12 VS 9/29,P0.05;高表達Nanog的患者的總生存期和無病生存期均明顯延長(P0.05)。2.2在過表達TSSC3的細胞模型上再次過表達了Nanog,檢測到過表達Nanog后其體外成球能力和成球體積都有顯著增強。(MTH細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.45±0.05個細胞球VS 0.83±0.12個,P0.05;Sa OS2細胞在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生0.35±0.13個細胞球VS 0.78±0.23個,P0.05)。過表達TSSC3的骨肉瘤細胞系的裸鼠成瘤能力明顯降低,再次過表達Nanog后其成瘤能力再次增強,MTH細胞成瘤數(shù)在每個注射點10000個細胞時為3/5 VS 2/5 VS 5/5,每個注射點1000個細胞時為2/5 VS 1/5 VS 5/5;Sa OS2細胞成瘤數(shù)在每個注射點40000個細胞時為4/5 VS 4/5 VS5/5,每個注射點4000個細胞時為3/5 VS 1/5 VS 4/5。2.3過表達Nanog的骨肉瘤細胞系的侵襲、遷移能力明顯增強(P0.05),并且在順鉑的化療抵抗實驗中其化療抵抗能力增強,通過劑量依賴曲線發(fā)現(xiàn)過表達Nanog后順鉑的IC50值也有很明顯升高。3.敲低Nanog的骨肉瘤細胞系的干性表型明顯下降。通過成球培養(yǎng)方法、裸鼠成瘤能力實驗、劃痕實驗和Transwell侵襲實驗、化療抵抗實驗等方法得到以下結果:3.1極限稀釋法發(fā)現(xiàn)敲低Nanog后的骨肉瘤細胞系其體外成球能力和成球體積都有顯著降低(MTH細胞敲低Nanog后在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生細胞球數(shù)為0.83±0.28 VS 0.28±0.22和0.68±0.21個,P0.05;Sa OS2細胞敲低Nanog后在5個/孔濃度下平均每個細胞能產(chǎn)生細胞球數(shù)為0.78±0.24 VS 0.52±0.23,0.37±0.25個,P0.05)。敲低Nanog后的MTH細胞成瘤數(shù)在每個注射點40000個細胞時為5/5 VS 3/5,每個注射點4000個細胞時為4/5 VS 2/5;Sa OS2細胞成瘤數(shù)在每個注射點40000個細胞時為5/5 VS 4/5,每個注射點4000個細胞時為4/5 VS 2/5。3.2劃痕實驗和Transwell侵襲實驗發(fā)現(xiàn)敲低Nanog的骨肉瘤細胞系的侵襲、遷移能力明顯減弱(P0.05)。在順鉑的化療抵抗實驗中其化療抵抗能力也有減弱,通過劑量依賴曲線發(fā)現(xiàn)敲低Nanog后順鉑的IC50值也有很明顯下降。4.Src介導了TSSC3敲低Nanog的作用通過成球培養(yǎng)方法、PT-PCR、Western-blot、藥物抑制實驗、si RNA轉染實驗、流式細胞術等方法得到以下結果:4.1在過表達TSSC3的細胞系中檢測了p-Src和p-Akt的表達,發(fā)現(xiàn)伴隨著TSSC3的上調(diào),p-Src和p-Akt的表達發(fā)生了下調(diào)。利用Src抑制劑PP2抑制Src通路活性,檢測到Nanog的表達下降(P0.05)。4.2利用Src si RNA和Lv-TSSC3進行同時處理,檢測Nanog的基因表達情況,發(fā)現(xiàn)敲低Src后可以抑制Nanog表達(P0.05),在此基礎上過表達TSSC3無法進一步抑制Nanog表達(P0.05)。敲低Src后可以抑制骨肉瘤細胞的體外成球數(shù)量和成球體積以及干性表面標記的表達(P0.05),在此基礎上過表達TSSC3后無法進一步抑制體外成球能力和干性表面標記的表達。5.Akt通路介導了TSSC3敲低Nanog的作用通過成球培養(yǎng)方法、PT-PCR、Western-blot、藥物抑制與刺激實驗、流式細胞術等方法得到以下結果:5.1 p-Src和p-Akt的表達在干細胞中的表達相對于對應的單層貼壁細胞中都明顯增強(P0.05)。利用Akt抑制劑LY294002對細胞進行持續(xù)培養(yǎng)后,發(fā)現(xiàn)抑制Akt磷酸化活性可以抑制Nanog表達(P0.05)。5.2利用Akt通路激活劑IGF1和Lv-TSSC3進行同時處理,發(fā)現(xiàn)Akt激活后可以明顯增強Nanog表達,而過表達TSSC3后再激活Akt通路可以回復Nanog的表達。在IGF1和Lv-TSSC3同時分組處理時,Akt激活后可以明顯增強體外成球數(shù)量和成球體積以及干性表面標記的表達,而過表達TSSC3后再激活Akt通路可以回復體外成球能力和干性表面標記表達。6.各分子表達與骨肉瘤病人臨床病理參數(shù)和預后的關系通過免疫組化方法和統(tǒng)計學分析,實驗得到了以下結果:p-Src高表達與骨肉瘤病人總生存期和無病生存期較短有極強的聯(lián)系(P0.05),而p-Akt表達與骨肉瘤病人預后沒有明顯聯(lián)系,P0.05。在臨床標本上p-Src表達與p-Akt表達有明顯正相關(P0.05),p-Src表達與Nanog表達有明顯正相關(P0.05)。p-Src表達量與病人轉移率正相關(發(fā)生轉移VS未發(fā)生轉移的患者的p-Src陽性比例為7/12 VS 8/29,P0.05),也與截肢手術采用率正相關(采用截肢手術VS采用局部切除手術的患者p-Src陽性比例為11/20 VS 4/21,P0.05),而Akt通路與以上參數(shù)沒有明顯聯(lián)系。二、Notch通路和內(nèi)皮細胞在維持OSC干性中發(fā)揮作用。1.通過成球培養(yǎng)法建立了U2OS的細胞球模型通過RT-PCR和Western-blot實驗檢測到U2OS細胞球中的干性轉錄因子Oct4、Nanog的表達相比相應的貼壁細胞都有明顯增高(P0.05),而Sox2在U2OS中表達量較低,沒有明確趨勢。2.Hes1是Notch通路在OSC中起作用的效應分子通過RT-PCR和Western-blot實驗,發(fā)現(xiàn)Notch通路的兩個重要下游效應分子Hes1、Hey1的表達,在三種細胞系的細胞球中都有明顯上調(diào)(P0.05);但是Hey1在蛋白水平并不能很明確的檢測到。3.DLL4是Notch通路在OSC中起作用的配體之一RT-PCR和Western-blot實驗檢測了Notch通路的眾多配體在干細胞和貼壁細胞中的表達差異,發(fā)現(xiàn)其中DLL4的表達上調(diào)最為明顯(P0.05),并且在三種干細胞球中都表現(xiàn)一致。4.Notch3是Notch通路在OSC中起作用的受體之一RT-PCR、Western-blot和免疫熒光實驗分析了四種Notch受體的表達和激活情況,發(fā)現(xiàn)Notch1、Notch3、Notch4的表達在不同的細胞球存在不同程度的表達上調(diào),Notch3的上調(diào)程度在三種干細胞球中最大,最一致(P0.05),而Notch3的效應剪切體在干細胞中的表達量也是明顯高于貼壁細胞的。只有Notch3在三種OSC中都出現(xiàn)了明顯的核轉位和表達上調(diào)的現(xiàn)象。5.內(nèi)皮細胞在維持OSC干性中可能通過Notch通路起作用利用直接細胞共培養(yǎng)模型檢測了和骨肉瘤細胞共培養(yǎng)的內(nèi)皮細胞HUVEC內(nèi)Notch配體表達,發(fā)現(xiàn)DLL1、DLL4明顯上調(diào)(P0.05);和內(nèi)皮細胞共培養(yǎng)的骨肉瘤細胞內(nèi)hey1和Nanog表達顯著上調(diào)(P0.05)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R738.1

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本文編號：1523035