本文關(guān)鍵詞： 斯鈣素1 腫瘤干細胞 卵巢癌　出處：《鄭州大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：卵巢癌位于盆腔深部,病變早期不易被發(fā)現(xiàn),且發(fā)病機制復(fù)雜,使其已成為威脅女性生命和健康的主要腫瘤之一,5年生存率徘徊在40%左右。盡管中外學(xué)者對卵巢癌的發(fā)生發(fā)展機制已經(jīng)進行了大量的研究,但是30年來卵巢癌治療效果并未明顯改善,對卵巢癌起源的認識依然遠不盡人意。隨著對腫瘤研究的深入,學(xué)者們提出腫瘤干細胞學(xué)說。該學(xué)說認為,腫瘤組織中有少量的細胞具有類似干細胞的相關(guān)特性,這類細胞被稱為腫瘤干細胞(CSCs)。對腫瘤干細胞的研究發(fā)現(xiàn),該類細胞數(shù)量極少(約占5%);能夠進行自我更新和多向分化;在體外無血清培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)能夠形成穩(wěn)定生長的球狀細胞;在裸鼠體內(nèi)具有極強的致瘤性;同時這類細胞群體對常規(guī)化療藥物有著明顯的耐藥性;是腫瘤耐藥和復(fù)發(fā)的根源。斯鈣素(STC)最早發(fā)現(xiàn)是主要參與鈣磷穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)的糖蛋白激素,并由STC1和STC2組成。越來越多的研究顯示,STC1與人體多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展均有密切的聯(lián)系。在前期研究中我們發(fā)現(xiàn),STC1基因高表達可以增強卵巢癌細胞的增殖、轉(zhuǎn)移、克隆形成、裸鼠體內(nèi)成瘤、化療耐藥等特性,表明STC1是卵巢癌的一種致癌基因,并且在懸浮培養(yǎng)的球狀細胞中,STC1基因較貼壁細胞明顯增高但是,STC1基因表達增高與球狀細胞形成關(guān)系并不明確,沉默STC1基因是否對卵巢癌干細胞的生物學(xué)行為產(chǎn)生影響依然不得而知。因此本課題以人卵巢癌SKOV3、HEY細胞系為研究對象,采用無血清懸浮培養(yǎng)方法富集球狀細胞,并且對球狀細胞進行腫瘤干細胞相關(guān)特性的初步研究,為進一步研究包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤干細胞生物學(xué)行為及發(fā)生機制奠定基礎(chǔ)。研究目的:1.通過無血清懸浮培養(yǎng)方法獲得卵巢癌球狀細胞,并探究STC1基因在卵巢癌球狀細胞中的表達規(guī)律。2.探討沉默STC1基因?qū)β殉舶┣驙罴毎磉_干細胞特性的影響。研究方法:1.將高表達STC1基因的卵巢癌細胞系SKOV3和HEY接種于完全培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng),待細胞生長至對數(shù)期,將貼壁細胞接種于無血清懸浮培養(yǎng)基中,觀察卵巢癌球狀細胞形成能力。通過Western blotting和RT-PCR方法檢測在不同培養(yǎng)時間的球狀細胞中STC1基因的表達水平。2.在前期研究中,我們發(fā)現(xiàn)卵巢癌SKOV3和HEY細胞高表達STC1基因,并成功沉默了SKOV3和HEY細胞中STC1基因的表達。將沉默STC1基因的卵巢癌細胞系SKOV3-STC1i和HEY-STC1i作為實驗組,將導(dǎo)入空載體si RNA的卵巢癌細胞系SKOV3-NC和HEY-NC作為對照組。3.通過觀察細胞球形成能力檢測沉默STC1基因?qū)β殉舶┣驙罴毎晕腋履芰Φ挠绊憽?.采用MTT方法和克隆形成實驗檢測沉默STC1基因?qū)山M卵巢癌球狀細胞增殖能力的影響。5.采用Transwell和劃痕實驗探討沉默STC1基因?qū)山M卵巢癌球狀細胞侵襲和遷移能力的影響。6.通過Western blotting方法和RT-PCR方法檢測兩組卵巢癌球狀細胞中干細胞標記物表達水平以及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)相關(guān)蛋白的表達水平。7.通過裸鼠體內(nèi)成瘤實驗檢測兩組卵巢癌球狀細胞成瘤能力的差異。8.通過向卵巢癌球狀細胞中加入不同濃度的化療藥物,檢測兩組球狀細胞化療耐藥能力的變化。研究結(jié)果1.將貼壁生長的卵巢癌細胞SKOV3和HEY接種于無血清培養(yǎng)基中進行懸浮培養(yǎng),24小時內(nèi)細胞大量死亡,存活的細胞進行融合并逐漸形成細胞球。隨著培養(yǎng)天數(shù)的增多,細胞球體積逐漸增大,細胞球數(shù)目逐漸增多。2.通過Western blotting方法和RT-PCR方法檢測發(fā)現(xiàn),隨著無血清懸浮培養(yǎng)天數(shù)逐漸增多,細胞內(nèi)STC1基因表達水平逐漸增高。3.沉默STC1基因的卵巢癌球狀細胞較未沉默STC1基因的卵巢癌球狀細胞,細胞球生長減慢、細胞球體積減小。4.通過MTT實驗發(fā)現(xiàn),球狀細胞SKOV3-STC1i細胞的490nm OD值與球狀細胞SKOV3-NC相比自第3天開始降低,第4天開始差異明顯(P0.05);球狀細胞HEY-STC1i細胞的OD值與球狀細胞HEY-NC相比自第2天開始降低,第3天開始差異明顯(P0.05)。在克隆形成實驗中,與SKOV3-NC細胞和HEY-NC細胞相比,沉默STC1基因的SKOV3-STC1i、HEY-STC1i細胞克隆的形成數(shù)量明顯減少(P0.05)5.Transwell侵襲小室體外侵襲實驗顯示,沉默STC1基因的SKOV3-STC1i球狀細胞的穿膜細胞數(shù)為(80±10),較對照組細胞SKOV3-NC(230±40)明顯減低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。劃痕實驗結(jié)果顯示:培養(yǎng)48小時后SKOV3-STC1i細胞劃痕未覆蓋率為(%)(0.53±0.049)明顯高于SKOV3-NC細胞(0.16±0.041)(P0.05)6.通過Western blotting方法和RT-PCR方法發(fā)現(xiàn),沉默STC1基因的卵巢癌球狀細胞腫瘤標記物水平明顯減低,EMT中上皮標記蛋白E-cadherin表達增高,但是間質(zhì)標記蛋白N-cadherin、Vimentin,核轉(zhuǎn)錄因子Snail-1、Snail-2表達程度則明顯降低。7.在裸鼠體內(nèi)成瘤實驗中,SKOV3-NC成瘤率為5/5,成瘤時間為9-14d;HEY-NC成瘤率為6/6,成瘤時間為10-16d,且兩組腫瘤均生長迅速,8周后形成明顯的腫瘤。SKOV3-STC1i成瘤率5/5,成瘤時間為18-22d;HEY-STC1i成瘤率5/6,成瘤時間為20-25d,且腫瘤生長速度均較緩慢,8周后所形成腫瘤體積明顯減小。8.在化療耐藥實驗中,在各濃度卡鉑或紫杉醇作用下,SKOV3-STC1i細胞的相對活性率明顯低于SKOV3-NC細胞。研究結(jié)論1、高表達STC1基因的卵巢癌細胞系SKOV3和HEY可以在無血清懸浮培養(yǎng)條件下形成球狀細胞,表達腫瘤干細胞特性之一。2、沉默STC1基因?qū)β殉舶┣驙罴毎哪[瘤干細胞學(xué)特性起到了抑制作用,推測STC1基因可能是調(diào)節(jié)卵巢癌干細胞特性基因之一。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R737.31
，

本文編號：1521023