本文關鍵詞： 肝細胞肝癌 肝移植 組蛋白H2AX 磷酸化組蛋白H2AX 缺氧　出處：《浙江大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景：在我國,原發(fā)性肝癌,簡稱肝癌是第二位癌癥殺手；由于我國是乙型病毒肝炎大國,全球每年78萬新發(fā)肝癌病例中約50%以上發(fā)生在我國。經過長期的努力,我國肝癌基礎研究與臨床治療都取得了顯著進展。然而,肝癌根治切除術后5年復發(fā)率高達60%,并且肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)也是影響受者存活的主要因素。由于肝癌組織有處于缺氧環(huán)境的特點,導致肝癌細胞在面對缺氧條件時,會誘發(fā)肝癌組織新生血管形成,腫瘤轉移等促進腫瘤存活的反應,從而使肝癌的惡性行為提高,降低肝癌患者預后。因此,探討缺氧條件下,肝癌復發(fā)轉移的分子機制,尋找肝癌復發(fā)轉移的標志物和有效的干預靶點,是早期診斷,早期治療,并進一步提高病人生存的關鍵。目的：本研究利用mRNA表達譜基因芯片篩選缺氧條件下肝癌細胞株與未缺氧肝癌細胞株間差異表達的mRNA,通過生物信息學分析尋找出與肝癌缺氧以及與肝癌發(fā)生發(fā)展相關的潛在標志物。對挑選出的潛在分子標記物H2AX及其磷酸化產物gammaH2AFX(γ-H2AX)首先在肝癌肝切病人以及肝癌肝移植病人肝癌組織和配對癌旁組織進行表達驗證,然后分析其與移植病人臨床病例資料以及肝移植術后病人預后的關系。最后通過各類分子生物學技術,進一步明確H2AX在肝癌細胞株中的腫瘤學功能,探究其在肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機制。方法：1.利用mRNA表達譜基因芯片技術(Affymetrix Human U133 plus 2.0 array)篩選不同時間點(2小時,8小時,24小時)缺氧條件下肝癌細胞株與未缺氧肝癌細胞株間差異表達的mRNA,并鑒定。2.收集32對HCC患者肝癌肝切病人腫瘤及配對癌旁冰凍組織,以及57例肝癌肝移植病人腫瘤組織,37例癌旁組織及17例正常肝臟組織石蠟標本,利用實時熒光定量PCR、免疫組化技術驗證差異表達蛋白組蛋白H2AX (H2A histone family member X)及其H2AX的S139位的磷酸化形成γ-H2AX在各類組織中的表達情況。3.根據(jù)免疫組化結果分析γ-H2AX與肝癌肝移植病人臨床病例資料以及移植術后病人總體及無瘤生存率的關系。4.通過構建干擾H2AX穩(wěn)轉Bel-7402和HepG2肝癌細胞株的方式,從而建立γ-H2AX低表達的肝癌細胞株,利用Cell Counting Kit-8 (CCK-8), Transwell細胞侵襲轉移實驗,體外血管形成實驗檢測H2AX在調控肝癌細胞增殖,侵襲轉移能力,以及血管形成中的作用。通過裸鼠皮下成瘤實驗觀察H2AX對肝癌細胞體內成瘤形成能力的影響,裸鼠尾靜脈肺轉移模型觀察H2AX肝癌細胞體內肺轉移的能力。5.利用蛋白芯片預測H2AX調控的下游蛋白。并利用Western blot,熒光共聚焦,免疫共沉淀技術探索H2AX缺氧條件下磷酸化γ-H2AX形成對肝癌發(fā)生發(fā)展的分子調控機制。結果：1.本實驗中mRNA表達譜基因芯片分析發(fā)現(xiàn)H2AX隨著缺氧時間的延長,肝癌細胞株的表達不斷降低。(倍數(shù)改變≥2.0倍,p0.05)。通過實時熒光定量PCR進行驗證,結果與芯片一致。2.實時熒光定量PCR結果表明H2AX mRNA水平在32對肝癌組織中表達與配對癌旁組織無統(tǒng)計學意義(p=0.3878)。免疫組化結果分析提示H2AX磷酸化形成的γ-H2AX表達在肝癌組織,癌旁組織,正常肝中表達逐漸降低。3.根據(jù)免疫組化結果,將γ-H2AX分為高低表達兩組。臨床資料統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn)γ-H2AX蛋白表達水平與肝癌肝移植患者腫瘤大小(p=0.022)、血管侵襲(p=0.005),TNM分期(p0.001)密切相關,與患者性別、腫瘤數(shù)目、甲胎蛋白(AFPA)水平等無關。Kaplan-Mier法分析發(fā)現(xiàn)γ-H2AX高表達患者總體生存率與無瘤生存率明顯低于γ-H2AX低表達組。4.細胞功能學實驗表明干擾H2AX表達后,肝癌細胞的增殖能力、侵襲能力以及體外血管形成降低,并且能夠減弱肝癌細胞的表皮-間質轉化(EMT)能力。裸鼠皮下成瘤實驗表明,干擾H2AX能夠明顯減弱肝癌細胞的體內成瘤能力,并且瘤體內的血管也明顯減少,裸鼠尾靜脈肺轉移模型實驗表明,干擾H2AX能夠有效減弱肝癌細胞體內肺轉移的能力。5.蛋白芯片結果顯示,H2AX能夠有效調節(jié)血管內皮生長因子(VEGF)的表達。缺氧條件下進一步的分子機制探索證明H2AX是表皮生長因子受體(EGFR)及缺氧誘導因子(HIF-1α)的上游基因,缺氧條件下,HIF-1α的異常升高可能由于H2AX磷酸化形成的γ-H2AX異常升高導致。而γ-H2AX升高能夠通過促進EGFR向細胞核內轉移而激活HIF-1α蛋白,HIF-1α蛋白的活化則促進VEGF的表達。因此我們在肝癌中發(fā)現(xiàn)了γ-H2 AX/EGFR/HIF-1α/VEGF信號通路,這條通路促進了肝癌在缺氧條件下的血管形成和遠處轉移能力。結論：1.肝癌肝移植患者γ-H2AX高表達者,其總體存活與無瘤存活率要明顯差于γ-H2AX低表達患者。γ-H2AX可能是肝癌肝移植術后腫瘤復發(fā)預測的潛在分子標志物；2.肝癌發(fā)生發(fā)展過程中存在γ-H2AX/EGFR/HIF-1α/VEGF信號通路,促進了肝癌在缺氧條件下的血管形成和遠處轉移能力。
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【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1518127