本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞肝癌 肝移植 組蛋白H2AX 磷酸化組蛋白H2AX 缺氧　出處：《浙江大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：在我國(guó),原發(fā)性肝癌,簡(jiǎn)稱肝癌是第二位癌癥殺手；由于我國(guó)是乙型病毒肝炎大國(guó),全球每年78萬新發(fā)肝癌病例中約50%以上發(fā)生在我國(guó)。經(jīng)過長(zhǎng)期的努力,我國(guó)肝癌基礎(chǔ)研究與臨床治療都取得了顯著進(jìn)展。然而,肝癌根治切除術(shù)后5年復(fù)發(fā)率高達(dá)60%,并且肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)也是影響受者存活的主要因素。由于肝癌組織有處于缺氧環(huán)境的特點(diǎn),導(dǎo)致肝癌細(xì)胞在面對(duì)缺氧條件時(shí),會(huì)誘發(fā)肝癌組織新生血管形成,腫瘤轉(zhuǎn)移等促進(jìn)腫瘤存活的反應(yīng),從而使肝癌的惡性行為提高,降低肝癌患者預(yù)后。因此,探討缺氧條件下,肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制,尋找肝癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物和有效的干預(yù)靶點(diǎn),是早期診斷,早期治療,并進(jìn)一步提高病人生存的關(guān)鍵。目的：本研究利用mRNA表達(dá)譜基因芯片篩選缺氧條件下肝癌細(xì)胞株與未缺氧肝癌細(xì)胞株間差異表達(dá)的mRNA,通過生物信息學(xué)分析尋找出與肝癌缺氧以及與肝癌發(fā)生發(fā)展相關(guān)的潛在標(biāo)志物。對(duì)挑選出的潛在分子標(biāo)記物H2AX及其磷酸化產(chǎn)物gammaH2AFX(γ-H2AX)首先在肝癌肝切病人以及肝癌肝移植病人肝癌組織和配對(duì)癌旁組織進(jìn)行表達(dá)驗(yàn)證,然后分析其與移植病人臨床病例資料以及肝移植術(shù)后病人預(yù)后的關(guān)系。最后通過各類分子生物學(xué)技術(shù),進(jìn)一步明確H2AX在肝癌細(xì)胞株中的腫瘤學(xué)功能,探究其在肝癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制。方法：1.利用mRNA表達(dá)譜基因芯片技術(shù)(Affymetrix Human U133 plus 2.0 array)篩選不同時(shí)間點(diǎn)(2小時(shí),8小時(shí),24小時(shí))缺氧條件下肝癌細(xì)胞株與未缺氧肝癌細(xì)胞株間差異表達(dá)的mRNA,并鑒定。2.收集32對(duì)HCC患者肝癌肝切病人腫瘤及配對(duì)癌旁冰凍組織,以及57例肝癌肝移植病人腫瘤組織,37例癌旁組織及17例正常肝臟組織石蠟標(biāo)本,利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR、免疫組化技術(shù)驗(yàn)證差異表達(dá)蛋白組蛋白H2AX (H2A histone family member X)及其H2AX的S139位的磷酸化形成γ-H2AX在各類組織中的表達(dá)情況。3.根據(jù)免疫組化結(jié)果分析γ-H2AX與肝癌肝移植病人臨床病例資料以及移植術(shù)后病人總體及無瘤生存率的關(guān)系。4.通過構(gòu)建干擾H2AX穩(wěn)轉(zhuǎn)Bel-7402和HepG2肝癌細(xì)胞株的方式,從而建立γ-H2AX低表達(dá)的肝癌細(xì)胞株,利用Cell Counting Kit-8 (CCK-8), Transwell細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移實(shí)驗(yàn),體外血管形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)H2AX在調(diào)控肝癌細(xì)胞增殖,侵襲轉(zhuǎn)移能力,以及血管形成中的作用。通過裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)觀察H2AX對(duì)肝癌細(xì)胞體內(nèi)成瘤形成能力的影響,裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型觀察H2AX肝癌細(xì)胞體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的能力。5.利用蛋白芯片預(yù)測(cè)H2AX調(diào)控的下游蛋白。并利用Western blot,熒光共聚焦,免疫共沉淀技術(shù)探索H2AX缺氧條件下磷酸化γ-H2AX形成對(duì)肝癌發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控機(jī)制。結(jié)果：1.本實(shí)驗(yàn)中mRNA表達(dá)譜基因芯片分析發(fā)現(xiàn)H2AX隨著缺氧時(shí)間的延長(zhǎng),肝癌細(xì)胞株的表達(dá)不斷降低。(倍數(shù)改變≥2.0倍,p0.05)。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果與芯片一致。2.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果表明H2AX mRNA水平在32對(duì)肝癌組織中表達(dá)與配對(duì)癌旁組織無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p=0.3878)。免疫組化結(jié)果分析提示H2AX磷酸化形成的γ-H2AX表達(dá)在肝癌組織,癌旁組織,正常肝中表達(dá)逐漸降低。3.根據(jù)免疫組化結(jié)果,將γ-H2AX分為高低表達(dá)兩組。臨床資料統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)γ-H2AX蛋白表達(dá)水平與肝癌肝移植患者腫瘤大小(p=0.022)、血管侵襲(p=0.005),TNM分期(p0.001)密切相關(guān),與患者性別、腫瘤數(shù)目、甲胎蛋白(AFPA)水平等無關(guān)。Kaplan-Mier法分析發(fā)現(xiàn)γ-H2AX高表達(dá)患者總體生存率與無瘤生存率明顯低于γ-H2AX低表達(dá)組。4.細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)表明干擾H2AX表達(dá)后,肝癌細(xì)胞的增殖能力、侵襲能力以及體外血管形成降低,并且能夠減弱肝癌細(xì)胞的表皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)能力。裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)表明,干擾H2AX能夠明顯減弱肝癌細(xì)胞的體內(nèi)成瘤能力,并且瘤體內(nèi)的血管也明顯減少,裸鼠尾靜脈肺轉(zhuǎn)移模型實(shí)驗(yàn)表明,干擾H2AX能夠有效減弱肝癌細(xì)胞體內(nèi)肺轉(zhuǎn)移的能力。5.蛋白芯片結(jié)果顯示,H2AX能夠有效調(diào)節(jié)血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的表達(dá)。缺氧條件下進(jìn)一步的分子機(jī)制探索證明H2AX是表皮生長(zhǎng)因子受體(EGFR)及缺氧誘導(dǎo)因子(HIF-1α)的上游基因,缺氧條件下,HIF-1α的異常升高可能由于H2AX磷酸化形成的γ-H2AX異常升高導(dǎo)致。而γ-H2AX升高能夠通過促進(jìn)EGFR向細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)移而激活HIF-1α蛋白,HIF-1α蛋白的活化則促進(jìn)VEGF的表達(dá)。因此我們?cè)诟伟┲邪l(fā)現(xiàn)了γ-H2 AX/EGFR/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路,這條通路促進(jìn)了肝癌在缺氧條件下的血管形成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。結(jié)論：1.肝癌肝移植患者γ-H2AX高表達(dá)者,其總體存活與無瘤存活率要明顯差于γ-H2AX低表達(dá)患者。γ-H2AX可能是肝癌肝移植術(shù)后腫瘤復(fù)發(fā)預(yù)測(cè)的潛在分子標(biāo)志物；2.肝癌發(fā)生發(fā)展過程中存在γ-H2AX/EGFR/HIF-1α/VEGF信號(hào)通路,促進(jìn)了肝癌在缺氧條件下的血管形成和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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