本文關(guān)鍵詞： 食管癌 miRNA-335 生存素 靶控　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:食管癌是臨床常見惡性腫瘤之一。我國是食管癌高發(fā)國家,每年約有15萬食管癌患者死亡,約占所有惡性腫瘤患者死亡總數(shù)的1/4。目前,關(guān)于食管癌發(fā)病機(jī)制的研究已取得較大進(jìn)展,但仍未完全探明。外科手術(shù)是食管癌的公認(rèn)根治性治療手段,但由于食管癌起病隱匿,且臨床癥狀缺乏特異性,故大部分食管癌患者就診時(shí)已發(fā)展至晚期,從而導(dǎo)致其喪失了最佳手術(shù)時(shí)機(jī)。食管癌即使是早期,但對(duì)多數(shù)患者而言依然是致命性的,可切除的食管癌患者5年總生存率僅為24%左右。放療、化療可有效提高食管癌局部控制率,改善遠(yuǎn)期生存率,是食管癌臨床治療的重要輔助手段。以手術(shù)、放療和化療為主的多學(xué)科綜合治療,越來越廣泛地運(yùn)用于食管癌的治療。但是放化療具有嚴(yán)重的毒副反應(yīng),在殺滅腫瘤的同時(shí)也會(huì)對(duì)機(jī)體正常組織細(xì)胞造成損害,且食管癌患者的遠(yuǎn)期生存率也不盡人意。局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致食管癌患者預(yù)后不良的主要因素,尋找更為有效的輔助治療方法和治療靶點(diǎn)抑制腫瘤局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是臨床亟待解決的重點(diǎn)及難點(diǎn)問題。微小RNA(micro RNA,mi RNA)是一類內(nèi)源性單鏈小分子RNA。人體內(nèi)的mi RNA可通過與靶基因3′-端非翻譯區(qū)(3′-UTR)配對(duì),實(shí)現(xiàn)對(duì)m RNA轉(zhuǎn)錄及翻譯的調(diào)控,從而在腫瘤細(xì)胞分化、增殖、凋亡等過程中發(fā)揮重要作用。隨著后基因組時(shí)代的到來,探索非編碼序列的生物學(xué)意義越來越重要,在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中對(duì)于mi RNA的探索成為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)。準(zhǔn)確預(yù)測(cè)mi RNA的靶標(biāo)基因,通過特異性調(diào)控mi RNA的表達(dá)可為惡性腫瘤臨床診斷和治療提供新思路。人類mi R-335定位于7q32.2,并與其下游多種基因存在靶控關(guān)系。研究證實(shí),骨肉瘤、肺癌、胃癌等惡性腫瘤組織中存在mi R-335低表達(dá)現(xiàn)象,并導(dǎo)致其靶基因調(diào)控異常,進(jìn)而為惡性腫瘤細(xì)胞增殖、分化提供有利條件。研究顯示,mi R-335在胃癌細(xì)胞中低表達(dá),上調(diào)mi R-335表達(dá)可有效抑制胃癌細(xì)胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力,提示mi R-335可能發(fā)揮抑制癌基因功能;但mi R-335在星形細(xì)胞瘤中呈高表達(dá),并且促進(jìn)細(xì)胞的增殖與侵襲,發(fā)揮著類似癌基因的功能。但mi R-335在食管癌中的表達(dá)及作用尚未完全明確。生存素(Survivin)作為一種凋亡抑制蛋白,具有多重生物學(xué)活性,參與腫瘤細(xì)胞增殖、凋亡過程,其可對(duì)抗有絲分裂期細(xì)胞的錯(cuò)誤凋亡,并在細(xì)胞有絲分裂中起著重要作用。生存素的高表達(dá)也出現(xiàn)在包括食管癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤組織內(nèi)。生物信息學(xué)基因組預(yù)測(cè):生存素可能是mi RNA-335的靶向基因之一。但mi RNA-335是否可通過靶向調(diào)控生存素參與食管癌細(xì)胞增殖及凋亡過程尚未可知。目的:本研究旨在探討mi RNA-335對(duì)食管癌細(xì)胞內(nèi)生存素的靶向調(diào)控作用及其對(duì)食管癌細(xì)胞增殖和凋亡的調(diào)節(jié)機(jī)制,以期為食管癌的臨床診斷及靶向治療提供可靠依據(jù)。第一章mi R-335和生存素在人食管癌組織及細(xì)胞株中的表達(dá)變化方法:選取食管癌組織、癌旁組織及正常組織;選取人正常食管上皮細(xì)胞,食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13。分別采用RT-PCR檢測(cè)組織和細(xì)胞中mi RNA-335表達(dá),采用Western Blot法檢測(cè)組織和細(xì)胞中生存素蛋白表達(dá)。結(jié)果:(1)與正常組織相比較,癌旁組織及食管癌組織mi R-335表達(dá)水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與癌旁組織相比較,食管癌組織mi R-335表達(dá)水平顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(2)與正常組織相比較,癌旁組織及食管癌組織生存素蛋白表達(dá)水平均顯著增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與癌旁組織相比較,食管癌組織生存素的蛋白表達(dá)水平明顯增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(3)與正常食管上皮細(xì)胞相比較,食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13中mi R-335 m RNA表達(dá)水平均顯著降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);食管癌細(xì)胞株中以Eca-109的mi R-335表達(dá)下調(diào)最為明顯,與TE-1、TE-13比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);(4)與正常食管上皮細(xì)胞相比較,食管癌細(xì)胞株Eca-109、TE-1、TE-13中生存素蛋白表達(dá)水平均顯著升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);食管癌細(xì)胞株中以Eca-109的生存素蛋白表達(dá)上調(diào)最為明顯,與TE-1、TE-13比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:食管癌組織及細(xì)胞中均呈現(xiàn)mi R-335 m RNA低表達(dá)現(xiàn)象;食管癌組織及細(xì)胞中均呈現(xiàn)生存素蛋白高表達(dá)現(xiàn)象。第二章mi R-335對(duì)食管癌細(xì)胞生物學(xué)特性影響的體外實(shí)驗(yàn)研究方法:選取食管癌細(xì)胞株Eca-109為研究對(duì)象,將細(xì)胞分為4組,即轉(zhuǎn)染miR-NC precursor組(pre-mi R-NC)、轉(zhuǎn)染mi R-335 precursor組(pre-mi R-335)、轉(zhuǎn)染mi R-NC inhibitor組(anti-mi R-NC)和轉(zhuǎn)染mi R-335 inhibitor組(anti-mi R-335)。轉(zhuǎn)染24h后,采用RT-PCR檢測(cè)mi RNA-335表達(dá),生存素蛋白的表達(dá)采用Western Blot法檢測(cè),細(xì)胞增殖采用MTT法檢測(cè),采用克隆集落形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞集落形成率,采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期,采用Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力,采用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞遷移能力。結(jié)果:(1)與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組中mi R-335表達(dá)水平明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組中mi R-335表達(dá)水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組中生存素蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組中生存素蛋白表達(dá)明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)MTT法檢測(cè)結(jié)果顯示,與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組細(xì)胞增殖水平明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組細(xì)胞增殖水平明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(4)克隆集落形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組細(xì)胞集落形成率明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組細(xì)胞集落形成率明顯明顯提高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組細(xì)胞凋亡率明顯上調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組細(xì)胞凋亡率明顯下調(diào),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(6)流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示,與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組細(xì)胞停留在G0/G1期的數(shù)目明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組細(xì)胞阻滯在S期的數(shù)目明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(7)與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組細(xì)胞侵襲數(shù)目明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(8)與pre-mi R-NC組相比較,pre-mi R-335組細(xì)胞遷移距離明顯縮短,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);而與anti-mi R-NC組相比較,anti-mi R-335組細(xì)胞遷移距離明顯增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:調(diào)控食管癌細(xì)胞中mi R-335表達(dá)可影響生存素表達(dá),從而影響食管癌細(xì)胞增殖、凋亡、侵襲及遷移等生物學(xué)特性。第三部分mi R-335靶控食管癌中生存素的實(shí)驗(yàn)研究方法選取食管癌細(xì)胞株Eca-109為研究對(duì)象,將人工合成的survivin基因3’UTR區(qū)序列克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒,將重組熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒和mi RNA mimics共轉(zhuǎn)染至Eca-109,采用雙熒光素酶檢測(cè)試劑盒測(cè)定熒光素酶活性。結(jié)果:熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示,survivin-3'UTR預(yù)測(cè)基因質(zhì)粒和mi RNA-335 precursor共轉(zhuǎn)染組與survivin-3'UTR預(yù)測(cè)基因質(zhì)粒和陰性對(duì)照共轉(zhuǎn)染組相比較,轉(zhuǎn)染組的熒光素酶表達(dá)明顯下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:生存素是mi R-335在食管癌中的直接靶基因。
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【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.1

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1516199