本文關鍵詞： 慢性粒細胞白血病 耐藥 BCR-ABL 嵌合泛素連接酶 靶向降解 前列腺癌 MIIP 細胞侵襲 上皮-間充質(zhì)轉化 蛋白酶體活性　出處：《第四軍醫(yī)大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：第一部分:嵌合泛素連接酶SH2-U-box靶向降解慢粒白血病中BCR-ABL及其突變的治療策略【研究背景】泛素-蛋白酶體系統(tǒng)(Ubiquitin-Proteasome System,UPS)是真核生物內(nèi)蛋白質(zhì)降解的主要途徑。通過促進底物蛋白質(zhì)的泛素化降解,UPS參與調(diào)控幾乎所有的細胞內(nèi)過程,包括細胞增殖、分化、凋亡、復制、轉錄等。在生理狀態(tài)下,UPS的正常運行對于細胞穩(wěn)態(tài)和功能維持至關重要,UPS異常與多種人類重大疾病如腫瘤、神經(jīng)退行性變密切相關。因此,基于UPS的疾病治療策略一直方興未艾。UPS介導的蛋白質(zhì)降解過程包括蛋白質(zhì)泛素化和蛋白酶體降解兩個環(huán)節(jié)。在泛素激活酶E1、泛素結合酶E2、泛素連接酶E3三種酶的協(xié)同作用下,由ATP供能,泛素分子(Ubiquitin,Ub)以共價鍵與底物蛋白質(zhì)結合使后者發(fā)生泛素化。通常K48-多聚泛素鏈作為蛋白質(zhì)降解信號,促使被修飾的蛋白質(zhì)在蛋白酶體中降解。由于E3含底物識別結構域/亞基,可特異性識別并結合底物蛋白質(zhì),決定著蛋白質(zhì)泛素化降解的特異性。利用E3的上述特性,通過精心設計和人為改變其底物識別特異性,理論上能夠?qū)崿F(xiàn)降解任意蛋白質(zhì),這一從蛋白質(zhì)水平調(diào)控目的蛋白質(zhì)含量的策略被喻為“靶向性蛋白質(zhì)敲除”,在蛋白質(zhì)功能研究以及疾病相關蛋白質(zhì)靶向治療策略中極具應用前景。以腫瘤相關蛋白作為分子靶點一直是腫瘤靶向性治療研究領域的熱點,其他研究者和我們一直在積極嘗試和探索多種靶向性降解消除致癌蛋白的新策略。慢性粒細胞白血病(Chronic myeloid leukemia,CML)是一類發(fā)生于造血系統(tǒng)的克隆型疾病,其標志性特征是由染色體易位產(chǎn)生融合基因Bcr-Abl,編碼致癌性BCR-ABL融合蛋白。BCR-ABL具有持續(xù)過度活化的酪氨酸激酶活性,通過募集Grb2(growth factor receptor-bound protein 2)等接頭蛋白,激活下游PI3K-Akt、MAPK、STAT5等多條信號通路,導致細胞過度增殖等惡性行為。因此,BCR-ABL也是CML治療的重要靶分子。針對BCR-ABL的第一代酪氨酸激酶抑制劑Imatinib盡管對始發(fā)CML的療效令人鼓舞,但隨之出現(xiàn)的Imatinib耐藥成為了CML治療所面臨的突出問題。導致Imatinib耐藥的主要原因是發(fā)生于BCR-ABL激酶區(qū)的點突變,這些突變多達40余種,其中以BCR-ABL T315I最為常見和難治,對第二代抑制劑如達沙替尼甚至第三代抑制劑如伯舒替尼均耐藥。因此,尋找針對BCR-ABL及其突變的新策略仍然是治療CML的挑戰(zhàn)�！狙芯磕康摹勘狙芯恐形覀円訡ML中的致癌蛋白BCR-ABL及其耐藥突變體作為靶點,通過將能夠識別并結合BCR-ABL及其耐藥突變的Grb2 SH2結構域與E3泛素連接酶CHIP的催化結構域U-box進行融合,構建嵌合泛素連接酶SH2-U-box,以實現(xiàn)特異性泛素化、降解BCR-ABL及其耐藥突變體,進而抑制CML并克服Imatinib耐藥。【實驗方法與結果】1.嵌合泛素連接酶SH2-U-box能夠與BCR-ABL及T315I結合,并促進其泛素化降解將能識別和結合BCR-ABL及其突變的SH2結構域與具有E3催化功能的結構域U-box通過重組PCR融合,構建為嵌合泛素連接酶SH2-U-box,以SH2(不含U-box)作為對照。通過電轉的方式導入表達BCR-ABL的K562細胞及其耐藥細胞株K562R(含T315I),Western blot結果表明,與對照相比SH2-U-box能夠顯著下調(diào)BCR-ABL及其突變T315I的蛋白水平;Real-time PCR結果則表明上述分子m RNA水平并未發(fā)生變化。將表達SH2-U-box或SH2的質(zhì)粒p FLAG-CMV4、與表達BCR-ABL或T315I的質(zhì)粒pc DNA3.1(-),共轉染至293T細胞中,免疫共沉淀實驗表明SH2-U-box和SH2均能夠與BCR-ABL或T315I結合;泛素化實驗則表明:SH2-U-box能夠顯著提高靶分子的泛素化,但SH2不具有該作用。CHX蛋白追蹤實驗表明SH2-U-box較SH2明顯縮短BCR-ABL及T315I的半衰期,且該作用可被蛋白酶體抑制劑MG132削弱。2.SH2-U-box穩(wěn)定表達可下調(diào)BCR-ABL及其下游信號通路,抑制K562及K562R的生長,在K562中與Imatinib具有疊加作用進一步利用慢病毒系統(tǒng)建立了穩(wěn)定表達e GFP,SH2或SH2-U-box的K562/K562R細胞,在這些細胞中采用Western blot證實SH2-U-box促進BCR-ABL及T315I的降解,下調(diào)其磷酸化水平;BCR-ABL下游STAT5、PI3K-Akt、MAPK信號通路的活化以及抗凋亡分子Bcl-x L均受到抑制。上述細胞穩(wěn)定表達SH2-U-box、SH2或e GFP的K562/K562R細胞,以Imatinib處理或不處理,采用CCK-8檢測細胞活力。結果表明,與對照e GFP組相比,SH2-U-box而非其SH2,能夠顯著抑制K562和K562R的生長。在K562細胞中,SH2-U-box與Imatinib聯(lián)用能夠協(xié)同抑制細胞增殖。過表達SH2-U-box或SH2的K562和K562R細胞施以Imatinib處理,流式細胞儀檢測細胞周期和凋亡。結果表明,SH2-U-box表達可增加K562和K562R細胞G1期、降低S期比例,并促進細胞凋亡;在K562細胞中,SH2-U-box同樣表現(xiàn)出與Imatinib的協(xié)同作用。3.SH2-U-box能夠在動物水平抑制K562及K562R皮下移植瘤的生長,并能抑制CML臨床病人原代細胞的生長我們分別在裸鼠和重癥免疫缺陷小鼠建立了K562和K562R的皮下荷瘤模型,待瘤體可見時,施以SH2-U-box或SH2慢病毒瘤體原位注射,監(jiān)測腫瘤生長情況。結果表明SH2-U-box處理組的腫瘤生長速度和瘤體質(zhì)量明顯小于SH2組。瘤體組織蛋白的Western blot結果顯示:與體外實驗結果一致,SH2-U-box處理組BCR-ABL及下游信號p-STAT5,p-Akt,p ERK等均抑制,SH2-U-box處理組可檢測出PARP切割條帶。瘤體組織的免疫組化結果表明SH2-U-box組的瘤體組織中Ki-67陽性較SH2處理組明顯降低。利用梯度離心法從兩例CML確診病人的骨髓中提取單核細胞和粒細胞。以攜帶SH2-U-box或SH2慢病毒感染原代細胞,CCK-8檢測細胞活力表明SH2-U-box能夠明顯抑制原代細胞的增殖,Western blot檢測結果表明在原代細胞中,SH2-U-box能夠明顯下調(diào)BCR-ABL和p-BCR-ABL及下游信號p-STAT5,p-Akt。【結論】SH2-U-box能夠有效結合BCR-ABL及耐藥突變BCR-ABL(T315I),促進它們發(fā)生泛素化并在蛋白酶體中降解,進而削弱相應的下游信號通路;從而抑制CML及其耐藥細胞的增殖,促進腫瘤細胞的凋亡;在K562細胞中,SH2-U-box還能夠與Imatinib聯(lián)用協(xié)同抑制腫瘤;動物實驗和原代CML實驗亦表明,SH2-U-box能夠抑制CML生長。該研究豐富和完善了靶向泛素化、降解致病相關蛋白這一治療策略的理論基礎,并為BCR-ABL陽性尤其是對已有治療方案耐藥的CML治療提供了新思路和方法。第二部分:MIIP與UPS交互作用探索及其在前列腺癌發(fā)生發(fā)展中的作用與機制【研究背景】前列腺癌(Prostatecancer,PCa)是男性最常見的惡性腫瘤,根據(jù)最新的統(tǒng)計結果,PCa位居男性腫瘤發(fā)病率第二、死亡率第六。盡管手術、激素治療以及放化療在臨床已經(jīng)廣為應用,但對于進展期和轉移PCa仍缺乏較好的治療方案。因此闡明PCa發(fā)生發(fā)展和轉移的分子機制,尋找新的干預策略,一直是PCa基礎和臨床研究的焦點。MIIP(Migration and Invasion Inhibitory Protein)是研究者最早在膠質(zhì)瘤中報道的IGFBP2的相互作用分子,因其具有抑制腫瘤細胞遷移侵襲作用而命名。MIIP基因位于染色體1p36.22,在乳腺癌、胰腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌等多種腫瘤中都檢測到了該段染色體的缺失。MIIP編碼的蛋白由388個氨基酸構成,包含RGD結構域和幾個潛在磷酸化位點。已有的研究表明,MIIP在膠質(zhì)瘤、結腸癌、子宮內(nèi)膜癌等多種腫瘤中低表達,通過與不同分子結合,調(diào)控細胞周期、細胞侵襲、染色體不穩(wěn)定性等腫瘤惡性特征,抑制腫瘤進展,提示MIIP具有抑癌功能,但在不同類型腫瘤中,其作用環(huán)節(jié)和機制遠未闡明。UPS(Ubiquitin-Proteasome System)異常、EMT(Epithelial-Mesenchymal Transition)等在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用已被廣泛認可,并逐漸成為腫瘤治療的重要干預靶位。一些抑癌基因產(chǎn)物可通過直接或間接調(diào)控上述過程而發(fā)揮抑癌功能。研究表明前列腺癌特別是去勢抵抗階段腫瘤細胞蛋白酶體活性明顯升高,但其具體的調(diào)控方式和機制并不清楚。【研究目的】本部分研究中,我們初步探索了MIIP對UPS的調(diào)控作用以及對前列腺癌細胞增殖、侵襲、EMT等惡性生物學行為的影響。從臨床標本、前列腺癌細胞系、荷瘤鼠四個層面研究了MIIP的抑癌作用�！緦嶒灧椒ㄅc結果】1.MIIP在PCa組織中低表達我們對21例前列腺癌患者的組織中檢測MIIP的蛋白水平,MIIP在半數(shù)以上(11/21)的患者癌組織中較癌旁組織下調(diào),其中7例MIIP表達的下調(diào)較為明顯。2.MIIP能夠抑制PCa細胞蛋白酶體活性為明確MIIP在前列腺癌中的作用,我們建立了穩(wěn)定表達MIIP的C4-2和LNCap細胞系,CCK8細胞活力檢測表明MIIP可抑制細胞生長,蛋白酶體活性檢測發(fā)現(xiàn)MIIP過表達能夠明顯抑制PCa細胞的Chymotrypsin-like活性。3.MIIP抑制PCa細胞的生長和侵襲,抑制腫瘤細胞的EMT我們在DU145和PC3細胞中,通過轉染MIIP過表達質(zhì)粒和MIIP si RNA調(diào)變MIIP。MTT、克隆形成、Transwell侵襲實驗表明MIIP過表達明顯抑制DU145和PC3細胞增殖、克隆形成能力和侵襲能力,而MIIP敲低則相反。Western blot結果表明敲低MIIP能夠顯著抑制上皮標志E-cadherin的表達,同時上調(diào)間充質(zhì)標志N-cadherin,Vimentin的表達。Real-time PCR結果也表明敲低MIIP后,CDH1(編碼E-cadherin)和CDH2(編碼N-cadherin)的變化與蛋白質(zhì)一致,SNAI1,SNAI2以及TWIST1的m RNA水平也有所上調(diào)。在MIIP過表達的DU145和PC3中,E-cadherin的蛋白水平上調(diào)而N-cadherin則下調(diào)。4.穩(wěn)定敲低MIIP促進裸鼠體內(nèi)的前列腺癌移殖瘤生長我們利用MIIP sh RNA慢病毒建立了穩(wěn)定敲減MIIP的DU145和PC3細胞系,MIIP穩(wěn)定敲低的細胞在顯微鏡下表現(xiàn)為間充質(zhì)樣并分散生長,Western blot和real-time PCR表明MIIP穩(wěn)定敲低對EMT標記分子以及SNAI1等的影響與瞬時敲低一致。裸鼠皮下注射上述細胞系建立荷瘤模型,監(jiān)測腫瘤生長,發(fā)現(xiàn)MIIP穩(wěn)定敲低的DU145和PC3生長與對照相比較快,30天后MIIP穩(wěn)定敲減組的瘤體質(zhì)量也較重。瘤體組織的Western blot實驗表明MIIP敲低的瘤體組織中MIIP表達較低,免疫組化結果表明MIIP敲低組中Ki-67陽性細胞數(shù)明顯增多�！窘Y論】本部分研究首次證實新近發(fā)現(xiàn)的抑癌基因MIIP在前列腺癌中通過調(diào)控EMT和UPS,抑制前列腺癌的惡性進程。我們發(fā)現(xiàn)過表達MIIP能夠抑制PCa細胞蛋白酶體活性,并上調(diào)E-cadherin,下調(diào)N-cadherin以及促EMT的相關轉錄因子(snail,slug,twist),進而抑制前列腺癌細胞的侵襲。裸鼠皮下荷瘤模型表明敲減MIIP表達能夠促進腫瘤生長。本課題將豐富前列腺癌中UPS、EMT的調(diào)控機制,揭示MIIP發(fā)揮抑癌功能的分子機制,為臨床防治前列腺癌進展提供新思路。
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【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R730.5
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本文編號：1514978