本文關(guān)鍵詞： 西紅花酸 KYSE-150細(xì)胞 凋亡 PI3K/Akt MAPK p53/p21 西紅花酸 順鉑 協(xié)同作用 凋亡 p53/p21　出處：《中山大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：食管癌是消化道常見(jiàn)的惡性腫瘤,其發(fā)病率在所有惡性腫瘤中,居世界第8,致死率居第6。我國(guó)更是世界食管癌第一高發(fā)國(guó)家,每年食管癌新發(fā)病例數(shù)約占全球總例數(shù)的50%。據(jù)報(bào)道2012年全球約有新增45萬(wàn)例食管癌患者,同年死亡40萬(wàn)例患者;我國(guó)同年新增22.3306萬(wàn)例,死亡19.7472萬(wàn)人,幾近一半的食管癌病例出現(xiàn)在我國(guó)。中國(guó)食管癌的流行具有顯著地理分布差異,廣東省特別是粵東地區(qū),食管癌的發(fā)病率居高不下。食管癌的致死率極高,預(yù)后差,5年生存率低于13%。由于食管癌早期臨床癥狀不典型和缺乏有效的篩查手段,大部分患者發(fā)現(xiàn)時(shí)已處于中晚期,已有不同程度的癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移。因此,化療仍是治療食管癌的重要手段。但是化療藥物大都存在嚴(yán)重的不良反應(yīng),很多病人因?yàn)椴荒苣褪懿涣挤磻?yīng)而不得不停止化療。此外,病人對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性也是臨床治療癌癥的一大難題,如順鉑首次劑量效應(yīng)顯著,但隨著化療時(shí)間延長(zhǎng)或癌癥復(fù)發(fā)后,順鉑的藥效顯著降低。因此,尋求新型、高效、不易產(chǎn)生耐藥性的以及不良反應(yīng)小的食管癌藥物是研究的熱點(diǎn)之一。近年來(lái),利用天然植物或從天然植物中提取有效成分來(lái)治療腫瘤引起了人們的關(guān)注。西紅花酸是從中藥西紅花中提取出來(lái)的有效物質(zhì),是一種多不飽和共軛烯酸,屬類胡蘿卜素類。已有文獻(xiàn)報(bào)道西紅花酸對(duì)胃癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、宮頸癌等具有抑制作用,但尚未報(bào)道對(duì)食管癌是否有抑制作用。因此,本實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部分探討西紅花酸對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的抑制作用;第二部分研究西紅花酸聯(lián)合順鉑對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的影響及其機(jī)制。第一部分西紅花酸對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究目的:本實(shí)驗(yàn)以人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞為食管癌的體外模型,探討西紅花酸對(duì)食管癌的抑制作用及其機(jī)制。方法:用MTT法檢測(cè)不同濃度西紅花酸對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的增殖抑制作用;Annexin V/PI染色結(jié)合倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;PI染色流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞周期;Rh123染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位MMP變化;Western blot法檢測(cè)PI3K/Akt、MAPK、p53/p21信號(hào)通路的變化,以及Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.西紅花酸呈濃度時(shí)間效應(yīng)抑制KYSE-150細(xì)胞增殖50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度的西紅花酸在作用24h后即能顯著抑制細(xì)胞增殖,細(xì)胞存活率分別是(77.78±4.51)%、(72.33±1.49)%、(58.13±4.86)%,較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。低濃度(12.5μmol/L、25μmol/L)西紅花酸則對(duì)KYSE-150細(xì)胞無(wú)抑制作用。當(dāng)西紅花酸作用時(shí)間延長(zhǎng)至48h后,25μmol/L濃度西紅花酸亦可以抑制KYSE-150細(xì)胞的增殖。25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度的西紅花酸處理48h后,其生存率分別是(91.81±4.83)%、(76.62±4.62)%、(63.45±5.51)%和(50.64±5.54)%,較對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。12.5μmol/L西紅花酸作用72h后也表現(xiàn)出顯著的增殖抑制作用。12.5μmol/L、25μmol/L、50μmol/L、100μmol/L、200μmol/L濃度的西紅花酸處理72h后,其生存率分別是(90.27±3.51)%、(74.94±4.78)%、(65.86±4.47)%、(54.02±4.03)%和(43.07±1.15)%,與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。西紅花酸作用KYSE-150細(xì)胞24h、48h、72h后,IC50分別是347.101μmol/L、186.205μmol/L、125.812μmol/L。2.西紅花酸有誘導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞凋亡的作用普通光鏡下正常對(duì)照組KYSE-150細(xì)胞貼壁性良好,胞體飽滿呈多邊形,胞質(zhì)清晰,邊界清楚。加入100μmol/L濃度西紅花酸孵育48h后,細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,細(xì)胞密度明顯低于對(duì)照組,且細(xì)胞皺縮,變圓,細(xì)胞邊界模糊,胞質(zhì)不清晰,培養(yǎng)液中出現(xiàn)顆粒物質(zhì)。200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞損傷更為嚴(yán)重,細(xì)胞數(shù)量急劇減少,且大部分細(xì)胞皺縮,胞質(zhì)不清,形態(tài)不規(guī)則,甚者部分細(xì)胞漂浮于培養(yǎng)液中。Annexin V-FITC/PI染色熒光顯微鏡下對(duì)照組細(xì)胞無(wú)熒光或僅有極少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)蘋果綠色細(xì)胞膜或黃紅色的細(xì)胞核。經(jīng)西紅花酸作用后凋亡細(xì)胞增多,表現(xiàn)為細(xì)胞膜呈現(xiàn)蘋果綠色,或細(xì)胞核呈黃紅色。200μmol/L濃度西紅花酸組凋亡細(xì)胞更多。3.西紅花酸誘導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞S期阻滯PI染色結(jié)合流式分析,結(jié)果顯示100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸均能夠誘導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞發(fā)生S期阻滯。100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組S期細(xì)胞所占百分比分別為(17.73±0.56)%、(23.33±0.88)%,與對(duì)照組(12.93±0.41)%相比顯著增加(P0.05)。與此同時(shí),西紅花酸組G0/G1期和M期細(xì)胞數(shù)量顯著下降。說(shuō)明西紅花酸具有將KYSE-150細(xì)胞阻滯于S期的作用。4.西紅花酸降低KYSE-150細(xì)胞線粒體膜電位Rh123染色后熒光顯微鏡下分析,顯示200μmol/L西紅花酸處理48h后,KYSE-150細(xì)胞線粒體對(duì)Rh123攝取顯著降低(P0.05),其平均熒光強(qiáng)度降到(78.39±1.58)%,提示線粒體膜電位降低。表明西紅花酸可降低細(xì)胞線粒體膜電位。5.西紅花酸調(diào)節(jié)KYSE-150細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bcl-2、Bax、cleaved caspase-3的表達(dá)西紅花酸作用48h后,細(xì)胞體內(nèi)促凋亡蛋白Bax、cleaved caspase-3表達(dá)上升,促生存蛋白Bcl-2表達(dá)下降。100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞內(nèi)Bax蛋白的表達(dá)水平分別是(72.20±7.54)%和(79.43±9.85)%,較對(duì)照組(45.84±2.97)%顯著上升(P0.05)。Cleaved caspase-3蛋白表達(dá)水平也明顯上升(P0.05),對(duì)照組和100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組分別是(28.93±6.25)%、(71.85±7.56)%和(90.58±5.87)%。與此同時(shí),西紅花酸處理組細(xì)胞內(nèi)的Bcl-2蛋白表達(dá)水平受到了抑制,100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組分別是(66.0±9.54)%和(56.90±6.73)%較對(duì)照組(93.10±9.57)%,明顯降低(P0.05)。6.西紅花酸抑制KYSE-150細(xì)胞內(nèi)PI3K/AKT信號(hào)通路的表達(dá)西紅花酸作用48h后,細(xì)胞體內(nèi)PI3K、Akt磷酸化受到抑制。對(duì)照組、100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞內(nèi)磷酸化PI3K蛋白的表達(dá)水平分別是(116.07±6.07)%、(100.76±5.74)%、(66.91±4.60)%,其中200μmol/L濃度西紅花酸組較對(duì)照組顯著下降(P0.05),具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。磷酸化Akt蛋白表達(dá)水平也明顯受到抑制(P0.05),對(duì)照組和100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組分別是(143.72±4.60)%、(112.94±2.03)%、(82.90±1.47)%。7.西紅花酸抑制KYSE-150細(xì)胞內(nèi)ERK1/2,P38磷酸化水平西紅花酸顯著下調(diào)了磷酸化的ERK1/2和磷酸化P38蛋白表達(dá)。西紅花酸處理細(xì)胞48h后,200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞體內(nèi)ERK1/2磷酸水平(27.82±9.76)%,較對(duì)照組(87.30±6.62)%顯著下降(P0.05)。但100μmol/L濃度西紅花酸組與對(duì)照組無(wú)明顯變化。100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞內(nèi)磷酸P38水平分別為(64.41±4.19)%、(34.17±7.87)%較對(duì)照組(89.12±2.40)%顯著下降(P0.05)。但不管是100μmol/L還是200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞內(nèi)磷酸化JNK與對(duì)照組比較均無(wú)變化。8.西紅花酸激活KYSE-150細(xì)胞內(nèi)p53/p21信號(hào)通路的表達(dá)西紅花酸處理48h后,100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組細(xì)胞內(nèi)p53蛋白的表達(dá)水平分別是(46.32±3.06)%和(53.23±5.14)%,較對(duì)照組(29.22±3.71)%顯著上升(P0.05)。P21蛋白表達(dá)水平也明顯上升(P0.05),對(duì)照組和100μmol/L、200μmol/L濃度西紅花酸組分別是(40.89±3.98)%、(66.39±8.46)%、(79.66±5.68)%。結(jié)論:1.西紅花酸可能具有抑制人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞增殖,促進(jìn)細(xì)胞凋亡,誘導(dǎo)S期阻滯的作用。2.西紅花酸可能通過(guò)抑制PI3K/AKT信號(hào)通路,抑制ERK1/2、P38磷酸化,激活p53/p21信號(hào)通路,進(jìn)而激活線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑降低細(xì)胞線粒體膜電位,上調(diào)Bax、cleaved caspase-3,下調(diào)Bcl-2表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。第二部分西紅花酸聯(lián)合順鉑對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的影響及機(jī)制目的:探討西紅花酸聯(lián)合順鉑對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞的作用及機(jī)制研究。方法:MTT法檢測(cè)不同濃度順鉑對(duì)KYSE-150細(xì)胞的影響,挑選出合適順鉑濃度。再用MTT法檢測(cè)西紅花酸、順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用對(duì)KYSE-150細(xì)胞增殖的影響。Annexin V/PI染色結(jié)合倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化;Rh123染色檢測(cè)細(xì)胞線粒體膜電位MMP變化;Western blot法檢測(cè)PI3K/Akt、MAPK、p53/p21信號(hào)通路的變化,以及Bax、Bcl-2、cleaved caspase-3蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:1.西紅花酸聯(lián)合順鉑協(xié)同抑制KYSE-150細(xì)胞增殖不同濃度順鉑對(duì)KYSE-150細(xì)胞具有增殖抑制作用且呈濃度時(shí)間效應(yīng)關(guān)系�？紤]臨床順鉑實(shí)際應(yīng)用中的不良反應(yīng),及有效性,我們選用2μg/m L濃度順鉑作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)工作濃度。KYSE-150細(xì)胞經(jīng)過(guò)西紅花酸、順鉑、西紅花酸聯(lián)合順鉑作用24h、48h、72h后西紅花酸聯(lián)合順鉑組的細(xì)胞生存率分別是(44.82±2.22)%、(29.28±2.21)%和(20.42±1.28)%,較西紅花酸(58.13±4.86)%、(50.64±5.54)%和(43.07±1.15)%,順鉑(80.01±3.51)%、(63.86±3.81)%和(28.00±1.26)%顯著抑制(P0.05)。西紅花酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞增殖抑制作用顯著強(qiáng)于西紅花酸或順鉑單獨(dú)作用組,且呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。2.西紅花酸聯(lián)合順鉑協(xié)同誘導(dǎo)KYSE-150細(xì)胞凋亡普通光鏡下和Annexin V/PI染色熒光顯微鏡下,觀察西紅花酸聯(lián)合順鉑對(duì)KYSE-150細(xì)胞的影響。普通光鏡下正常對(duì)照組KYSE-150細(xì)胞貼壁性良好,胞體飽滿呈多邊形,胞質(zhì)清晰,邊界清楚,細(xì)胞立體感明顯。順鉑組細(xì)胞較正常對(duì)照組細(xì)胞數(shù)量減少,胞體腫脹,胞質(zhì)不清晰,細(xì)胞邊界模糊。西紅花酸組細(xì)胞生長(zhǎng)明顯受到抑制,細(xì)胞密度明顯低于對(duì)照組,且細(xì)胞皺縮,變圓,細(xì)胞邊界模糊,胞質(zhì)不清晰,培養(yǎng)液中出現(xiàn)顆粒物質(zhì)。西紅花酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞損傷最為嚴(yán)重,細(xì)胞皺縮變圓,細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則,細(xì)胞邊界不清,大量細(xì)胞脫落漂浮在培養(yǎng)液中。3.西紅花酸聯(lián)合順鉑協(xié)同降低KYSE-150細(xì)胞線粒體膜電位西紅花酸、順鉑單獨(dú)或聯(lián)合作用48h后,KYSE-150細(xì)胞攝取Rh123顯著降低,西紅花酸聯(lián)合順鉑組Rh123熒光強(qiáng)度為(73.27±0.35)%,較順鉑組(81.98±1.94)%顯著降低(P0.05),與西紅花酸組(82.12±1.14)%相比也明顯降低(P0.05)。4.西紅花酸聯(lián)合順鉑協(xié)同上調(diào)KYSE-150細(xì)胞內(nèi)促凋亡蛋白cleaved caspase-3表達(dá),下調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)西紅花酸、順鉑、西紅花酸聯(lián)合順鉑作用48h后,西紅花酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞內(nèi)Bcl-2表達(dá)水平為(30.70±4.53)%較西紅花酸組(66.66±3.43)%顯著降低(P0.05),與順鉑(89.36±17.84)%組相比也顯著下調(diào)(P0.05)。西紅花酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞內(nèi)Bax表達(dá)水平為(129.71±5.40)%,與西紅花酸組(96.85±7.62)%相比顯著上升(P0.05),但與順鉑組(125.93±1.98)%相比無(wú)明顯變化。西紅花酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞內(nèi)cleaved caspase-3表達(dá)水平為(122.59±10.59)%,較西紅花酸(85.13±8.74)%顯著增多(P0.05),與順鉑組(74.19±3.71)%相比也顯著上升(P0.05)。5.西紅花酸聯(lián)合順鉑激活KYSE-150細(xì)胞內(nèi)p53/p21信號(hào)通路的表達(dá)西紅花酸、順鉑、西紅花酸聯(lián)合順鉑作用KYSE-150細(xì)胞48h后。西紅花酸聯(lián)合順鉑組細(xì)胞內(nèi)p53、p21表達(dá)水平分別為(118.57±2.21)%、(109.30±4.82)%,與順鉑組(99.51±3.25)%、(85.77±5.90)%,西紅花酸組(59.05±9.21)%、(87.16±2.74)%,顯著升高(P0.05)。6.P53抑制劑PFT-α可部分逆轉(zhuǎn)西紅花酸聯(lián)合順鉑的協(xié)同作用加入p53抑制劑PFT-α后,PFT-α+西紅花酸+順鉑組細(xì)胞活力為(34.03±2.10)%較西紅花酸聯(lián)合順鉑(23.42±1.01)%顯著升高(P0.05),細(xì)胞凋亡也明顯減少。PFT-α+西紅花酸+順鉑組Rh123熒光強(qiáng)度為(87.94±2.79)%,較西紅花酸聯(lián)合順鉑組(66.44±1.84)%明顯升高(P0.001)。PFT-α+西紅花酸+順鉑組細(xì)胞Bcl-2蛋白表達(dá)為(93.41±11.17)%,較西紅花酸聯(lián)合順鉑組(60.32±9.15)%顯著上升(P0.05)。PFT-α+西紅花酸+順鉑組細(xì)胞cleaved caspase-3蛋白表達(dá)為(146.64+8.47)%,較西紅花酸聯(lián)合順鉑組(173.30±5.74)%顯著下降(P0.05)。表明PFT-α可抑制西紅花酸聯(lián)合順鉑協(xié)同引起的增殖抑制,促進(jìn)凋亡,膜電位降低,促凋亡蛋白表達(dá)。結(jié)論:1.西紅花酸聯(lián)合順鉑對(duì)人食管鱗癌KYSE-150細(xì)胞可能具有增殖抑制,降低MMP,促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。2.西紅花酸聯(lián)合順鉑的協(xié)同作用,可能是通過(guò)調(diào)節(jié)p53/p21信號(hào)通路來(lái)實(shí)現(xiàn)的,使用p53抑制劑能部分逆轉(zhuǎn)西紅花酸聯(lián)合順鉑的協(xié)同增殖抑制作用、降低MMP、促進(jìn)凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.1
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本文編號(hào)：1514173