本文關(guān)鍵詞： GDF11 A549 放射敏感性 凋亡　出處：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:生長分化因子11(growth differentiation factor 11,GDF11)又稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白11(bone morphogenetic protein 11,BMP11),既屬于TGFβ超家族成員,也屬于骨形態(tài)蛋白亞家族蛋白。其在腎臟、脾臟、肌肉、胰臟、小腸和發(fā)育的神經(jīng)等組織中廣泛表達(dá),并循環(huán)于血液中,隨年齡增加而減少表達(dá)。早期胚胎發(fā)育中,GDF11通過負(fù)向調(diào)節(jié)MAPK/AKT/mTOR信號(hào)通路,參與骨骼、腎臟、胰腺、視網(wǎng)膜、嗅神經(jīng)等組織器官的形成和分化,被認(rèn)為是胚胎正常發(fā)育的關(guān)鍵信號(hào)分子。近年來,研究發(fā)現(xiàn)GDF11在改善大腦認(rèn)知、逆轉(zhuǎn)心肌肥厚、調(diào)節(jié)骨骼肌代謝等方面具有非常重要的功能,顯示出GDF11在調(diào)解細(xì)胞老齡化中具有極其重要的生物學(xué)功能以及潛在的應(yīng)用價(jià)值。目前,GDF11的生物學(xué)功能并未研究清楚,尤其是在腫瘤細(xì)胞中的功能,鮮見報(bào)道。本研究以常見的肺正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象,觀察GDF11在肺細(xì)胞中的表達(dá)譜;探索GDF11表達(dá)與電離輻射之間的關(guān)系;探究外源上調(diào)表達(dá)GDF11對(duì)肺癌細(xì)胞放射敏感性的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在揭示GDF11在增強(qiáng)肺癌放射敏感性的功能及分子作用機(jī)制。方法:1.選用肺常見細(xì)胞H1299、A549、BEAS-2B和HBE細(xì)胞株,通過western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)GDF11蛋白表達(dá)。2.對(duì)細(xì)胞進(jìn)行X射線照射處理后,western blot檢測(cè)GDF11蛋白表達(dá)的變化。3.設(shè)計(jì)合成GDF11的引物序列,經(jīng)RT-PCR合成目標(biāo)基因片段。pcDNA3.1質(zhì)粒經(jīng)雙酶切后與GDF11片段連接,目的質(zhì)粒經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證,同時(shí)測(cè)序驗(yàn)證其準(zhǔn)確性。脂質(zhì)體法將構(gòu)建的pcDNA3.1-GDF11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中GDF11蛋白表達(dá)變化,確定其是否成功表達(dá)。4.分別用構(gòu)建的GDF11質(zhì)粒轉(zhuǎn)染,X線照射和GDF11聯(lián)合X線照射處理A549細(xì)胞,通過克隆形成實(shí)驗(yàn)觀察細(xì)胞的放射敏感性;MTT實(shí)驗(yàn)分析GDF11高表達(dá)對(duì)A549細(xì)胞生長和增殖方面的影響;Annexin V/PI凋亡試劑及流式細(xì)胞儀分析技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況;western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Puma,Bcl-2,Bax的表達(dá)。結(jié)果:1.HBE、BEAS-2B、H1299和A549細(xì)胞中均有Qg源性GDF11的表達(dá),但不同細(xì)胞GDF11表達(dá)不同,其中正常細(xì)胞中GDF11的表達(dá)要高于腫瘤細(xì)胞。2.GDF11是可受電離輻射誘導(dǎo)表達(dá)的基因。在時(shí)間方面,電離輻射后,GDF11的表達(dá)在48h內(nèi)隨著時(shí)間的增加而增加;劑量方面,GDF11的表達(dá)在0~6Gy內(nèi)隨著劑量的增加而增加。3.成功構(gòu)建GDF11表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞,通過western blot驗(yàn)證表達(dá)結(jié)果,過表達(dá)率為200%。4.克隆形成實(shí)驗(yàn)證實(shí),A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染GDF11后與對(duì)照組相比,其克隆形成率明顯降低,放射敏感性增加32%;MTT實(shí)驗(yàn)顯示,GDF11明顯抑制A549細(xì)胞的生長,抑制率為22.3%;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示,在24h時(shí),GDF11轉(zhuǎn)染組的凋亡率為27.17%,高于對(duì)照組的18%,在48h時(shí),GDF11聯(lián)合照射組的凋亡率為39.63%,高于照射組的34.99%;western blot檢測(cè)顯示,抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào),促凋亡蛋白Puma和Bax表達(dá)上調(diào)。結(jié)論:1.HBE、BEAS-2B、H1299和A549細(xì)胞中均存在GDF11。2.GDF11的表達(dá)受到電離輻射的誘導(dǎo),且具有時(shí)間和劑量效應(yīng)。3.成功構(gòu)建GDF11表達(dá)載體并成功轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞。4.GDF11過表達(dá)明顯抑制A549細(xì)胞的生長,并通過下調(diào)Bcl-2蛋白的表達(dá),上調(diào)促凋亡蛋白Bax和Puma蛋白的表達(dá)從而促進(jìn)A549細(xì)胞的凋亡以及輻射敏感性。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of GDF11 in human lung cancer , and to investigate the effect of GDF11 on the radiosensitivity of lung cancer cells . The expression of apoptosis - related protein Puma , Bcl - 2 and Bax was detected by western blot . Results : The expression of GDF11 was significantly lower than that in control group . The expression of Bax and Puma proteins was up - regulated to promote the apoptosis and radiation sensitivity of A549 cells .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R734.2

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1 趙曉嵐;GDF11對(duì)肺部腫瘤細(xì)胞輻射敏感性的研究[D];蘇州大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1512772