本文關(guān)鍵詞： 結(jié)直腸癌 組蛋白甲基化 SETDB1 TP53 NOTCH1 STAT1 ~*cNOTCH1 cleavage NOTCH1 蛋白(NOTCH1 的活化狀態(tài))　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的及意義結(jié)直腸癌是消化道常見惡性腫瘤之一,近年來隨著生活節(jié)奏的加快、飲食及環(huán)境的改變,我國結(jié)直腸癌的發(fā)病率有上升的趨勢[1,2]。受社會經(jīng)濟發(fā)展和檢測方法等的制約,許多患者沒有得到準確的個體化治療[3-5],治療獲益少,錯過了治療的最佳時機,增加了家庭負擔,浪費了社會醫(yī)療成本。因此,尋找結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展過程中的關(guān)鍵基因,深入研究其功能機制,具有重要的臨床意義及社會效益。SETDB1主要參與組蛋白H3K9的三甲基化過程,通常引起基因的沉默或轉(zhuǎn)錄性抑制[6-9]。近年來的研究發(fā)現(xiàn),SETDB1蛋白的異常表達與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展存在著十分密切的關(guān)系[10-15]。目前未有SETDB1蛋白在結(jié)直腸癌中的表達研究,我們的前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)SETDB1蛋白在結(jié)直腸組織中存在高表達情況,提示其表達也同結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展存在聯(lián)系,但其分子機制仍不明確。NOTCH1是NOTCH信號通路的受體之一[16],NOTCH通路的異�；罨瘏⑴c了多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程[17-20],同時NOTCH通路的激活在腫瘤形成的過程中也可以起抑制作用[21,22],深入研究的結(jié)果提示,在結(jié)直腸癌中這種抑制作用可能同組蛋白甲基化抑制及NOTCH/WNT通路交互作用有一定關(guān)系,但其作用的具體分子機制尚不明確[23]。因此本研究將進一步觀察SETDB1及NOTCH1蛋白在結(jié)直腸癌組織中的表達情況,探索其功能的分子機制,為結(jié)直腸癌個體化治療提供理論依據(jù)。材料及方法1、利用Western blot、熒光實時定量PCR及免疫組織化學等技術(shù)檢測SETDB1蛋白在結(jié)直腸癌細胞系、新鮮組織及石蠟切片中的表達情況,并分析SETDB1的表達同預后關(guān)系;2、建立SETDB1蛋白過表達及干擾的結(jié)直腸癌細胞穩(wěn)定株,利用CCK8、平板克隆形成實驗及裸鼠皮下成瘤實驗檢測穩(wěn)定株的體內(nèi)外增值能力的變化,利用細胞劃痕實驗、Transwell小室檢測穩(wěn)定株的體外遷移能力的變化,利用流式細胞技術(shù)檢測穩(wěn)定株的凋亡及周期變化;3、利用5-氟尿嘧啶(5-Fu)誘導結(jié)直腸癌細胞凋亡,利用流式細胞技術(shù)檢測SETDB1干擾及過表達細胞株的抗凋亡能力變化,利用Western blot技術(shù)檢測TP53、BCL2、BAX等凋亡相關(guān)基因的變化,利用CHIP-PCR技術(shù)檢測TP53基因啟動子SETDB1結(jié)合位點;4、利用Western blot、免疫組織化學技術(shù)檢測SETDB1蛋白及cNOTCH1蛋白在結(jié)直腸癌細胞系及石蠟切片中的共表達情況,并分析SETDB1及cNOTCH1不同的表達組合與組織預后的關(guān)系;5、利用NOTCH1激活劑(多西環(huán)素)及抑制劑(Y-分泌酶抑制劑,DAPT)作用于SETDB1不同表達情況的細胞株,利用CCK8及平板克隆形成實驗檢測處理細胞株的體內(nèi)外增值能力的變化,利用細胞劃痕實驗、Transwell小室檢測處理細胞株的體外遷移能力的變化;6、利用基因芯片技術(shù)探索在NOTCH活化的結(jié)直腸癌細胞株中SETDB1干擾后相關(guān)基因變化,利用Western blot技術(shù)驗證STAT1表達情況。結(jié)果1、SETDB1在結(jié)直腸癌中的表達情況1)相對于正常結(jié)腸上皮細胞株(NCM460細胞株),SETDB1在數(shù)種結(jié)腸癌細胞株內(nèi)均有不同程度的上調(diào);8例結(jié)直腸癌組織中SETDB1蛋白的表達水平高于相匹配的癌旁組織;2)SETDB1陽性表達主要定位于細胞核,呈不同程度的黃褐色,在46.7%(14/30)的結(jié)直腸癌組織中呈強陽性表達,其中高中分化組強陽性比例達到55%,低分化組強陽性比例為30%;3)選取結(jié)直腸癌石蠟切片102例檢測SETDB1的表達,采用Kaplan-meier法進行生存分析,結(jié)果顯示,結(jié)直腸癌組織中SETDB1低表達組年總體生存率顯著高于高表達組,具有統(tǒng)計學差異。2、SETDB1表達在結(jié)直腸癌中功能的體內(nèi)外驗證1)構(gòu)建SETDB1過表達及干擾慢病毒載體,成功構(gòu)建SETDB1過表達及干擾穩(wěn)定結(jié)直腸癌細胞株,采用Western blot、熒光實時定量PCR檢測過表達及干擾效率;2)SETDB1過表達后顯著增加結(jié)直腸癌細胞的增殖及遷移能力;3)干擾SETDB1表達后結(jié)直腸癌細胞的增殖及遷移能力明顯減弱。3、SETDB1表達對結(jié)直腸細胞凋亡的影響1)SETDB1過表達及干擾組細胞相對于對照組細胞,凋亡率均未有明顯變化,干擾組細胞相對于對照組細胞出現(xiàn)明顯的G2期阻滯,過表達組未有明顯變化;2)5-Fu誘導凋亡后,SETDB1過表達組相對于對照組,凋亡率明顯減少,TP53表達較少,而干擾組明顯增加,TP53表達顯著增加。BAX及BCL-2未有明顯變化;3)SETDB1過表達組相對于對照組,H3K9三甲基化明顯增多,CHIP-QPCR結(jié)果顯示,TP53啟動子區(qū)域SETDB1結(jié)合位點。4、SW480細胞株SETDB1干擾后細胞增殖及遷移能力增強。5、結(jié)直腸癌組織中SETDB1及cNOTCH1共表達情況1)選取與檢測SETDB1表達水平同樣的102例石蠟切片檢測cNOTCH1共表達情況,結(jié)果顯示:SETDB1的陽性例數(shù)為79例占77.45%,cNOTCH1的陽性例數(shù)為47例占46.08%,cNOTCH1的表達與預后之間呈負相關(guān);2)根據(jù)2種蛋白的表達情況,我們將結(jié)直腸癌組織分成4個小群,然后觀察他們的表達情況同預后的關(guān)系,結(jié)果表明,SETDB1(+)cNOTCH1(-)及SETDB1(-)cNOTCH1(-)與預后之間呈負相關(guān);3)DLD1 細胞株表達為 SETDB1(-)cNOTCH1(-),SW480 細胞株表達為 SETDB1(+)cNOTCH1(+)。6、NOTCH1激活劑(多西環(huán)素)及抑制劑(γ-分泌酶抑制劑,DAPT)作用后的細胞增殖遷移能力變化1)應用NOTCH1激活劑后,細胞內(nèi)HES1表達增高,DLD1細胞株處理組較未處理組細胞增值及遷移能力增強而SETDB1過表達的DLD1細胞株得到反向結(jié)果;2)應用NOTCH1抑制劑,細胞內(nèi)HES1表達下降,SW480細胞株處理組較未處理組細胞生長速度加快而SETDB1干擾的SW480細胞株得到反向結(jié)果。7、基因芯片檢測相對于對照組細胞,SW480細胞株SETDB1干擾后有279個基因上調(diào),204個基因出現(xiàn)下調(diào)。8、STAT1在SW480細胞中的表達情況Western blot檢測結(jié)果顯示,SW480細胞株SETDB1干擾后STAT1細胞出現(xiàn)明顯下調(diào)。結(jié)論1、SETDB1在結(jié)直腸癌組織及細胞中明顯上調(diào),其表達水平同臨床預后相關(guān);2、SETDB1過表達后顯著增加結(jié)直腸癌細胞的增殖及遷移能力,干擾SETDB1表達后結(jié)直腸癌細胞的增殖及遷移能力明顯減弱;3、SETDB1表達上調(diào)后通過下調(diào)結(jié)直腸癌細胞TP53表達促進結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展;4、SETDB1表達功能受NOTCH1蛋白活化狀態(tài)的影響,兩者不同的表達組合影響結(jié)直腸癌細胞的增值及遷移能力及臨床預后;針對NOTCH1的治療藥物療效隨SETDB1不同的表達狀態(tài)發(fā)生變化,提示其藥物選擇個體化的需要。5、NOTCH1蛋白活化狀態(tài)下,SETDB1通過上調(diào)STAT1表達抑制結(jié)直腸癌細胞增值遷移。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.3

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本文編號：1508844