本文關(guān)鍵詞： 過繼免疫細(xì)胞治療 基因治療 溶瘤腺病毒 IL-12基因 Ad5/11嵌合型腺病毒 細(xì)胞運(yùn)輸載體 細(xì)胞膜交換 病毒轉(zhuǎn)移　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率居高不下,嚴(yán)重危害人類健康,傳統(tǒng)治療方法對中晚期患者療效非常有限,臨床上亟待研究更為有效的治療方法。生物治療中的免疫細(xì)胞治療和基因治療近年來發(fā)展迅速,接連在技術(shù)和療效上取得突破,受到廣泛關(guān)注。免疫細(xì)胞治療中的過繼免疫療法(adoptive cell therapy)已在臨床廣泛應(yīng)用并取得一定的治療效果。然而由于肝癌瘤內(nèi)腫瘤微環(huán)境相對復(fù)雜,細(xì)胞浸潤不足,且浸潤的免疫細(xì)胞無法發(fā)揮腫瘤殺傷作用,而且在這些免疫抑制信號的作用下效應(yīng)細(xì)胞大量死亡或衰竭。因此如何突破腫瘤微環(huán)境的限制,提高免疫治療的效果是目前研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)。溶瘤病毒介導(dǎo)的基因治療(“病毒-基因”治療)是基因治療中的一個(gè)新策略,利用溶瘤病毒在腫瘤組織中不斷復(fù)制和再感染作用,可最大程度地感染腫瘤細(xì)胞,并長期維持基因的表達(dá)。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒在感染和裂解腫瘤細(xì)胞后能產(chǎn)生“危險(xiǎn)”信號、釋放Ⅰ型干擾素并暴露腫瘤抗原。腫瘤內(nèi)的抗原遞呈細(xì)胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別危險(xiǎn)信號,并遞呈腫瘤抗原,可引發(fā)宿主產(chǎn)生針對腫瘤的免疫反應(yīng)。利用溶瘤病毒載體大量表達(dá)免疫活化因子或抑制性受體的阻斷劑,可進(jìn)一步解除腫瘤免疫抑制,增強(qiáng)抗腫瘤的免疫反應(yīng)作用。IL-12是一種重要的免疫活化因子,其可直接作用于T淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞,在天然免疫反應(yīng)和過繼免疫反應(yīng)中扮演重要的角色。IL-12除了直接作用于免疫系統(tǒng)促進(jìn)免疫活化外,還能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞上調(diào)表達(dá)內(nèi)皮粘附分子對引導(dǎo)T淋巴細(xì)胞浸潤至腫瘤組織具有促進(jìn)作用�；谝陨显�,本課題的第一部分希望探討將“細(xì)胞過繼免疫療法”與“病毒-基因”療法進(jìn)行聯(lián)合的可行性。一方面通過“病毒-基因”療法向腫瘤病灶直接注射表達(dá)免疫活化基因IL-12的溶瘤腺病毒,利用病毒的溶瘤作用和腫瘤局部表達(dá)高濃度的IL-12因子,打破腫瘤免疫抑制微環(huán)境,產(chǎn)生急性炎癥環(huán)境。另一方面通過外源輸注過繼免疫細(xì)胞CIK,使外源的免疫細(xì)胞在急性炎癥環(huán)境下更好的發(fā)揮抗腫瘤作用。實(shí)現(xiàn)“細(xì)胞-病毒-基因”強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的治療效果。雖然“病毒-基因”療法具有諸多優(yōu)點(diǎn),顯示出廣泛的治療前景,然而受到藥物輸注方式的制約,限制其適應(yīng)癥范圍。1)腫瘤局部注射,即將藥物直接注射到腫瘤組織。這種給藥方法病毒能最大限度地到達(dá)腫瘤組織。但這種方式對部分患者損傷較大,需要手術(shù)配合,具有風(fēng)險(xiǎn),且惡性腫瘤多呈彌散性生長或廣泛轉(zhuǎn)移,難以實(shí)現(xiàn)原位直接注射。2)脈管系統(tǒng)輸注,該方法操作相對簡單,藥物能夠通過血液系統(tǒng)運(yùn)輸至各個(gè)組織器官,解決彌散性轉(zhuǎn)移難題。然而病毒類藥物直接暴露于血液系統(tǒng)中,病毒將被血管內(nèi)皮細(xì)胞和血細(xì)胞大量非特異吸附,或被抗體中和失去感染能力。加之血液系統(tǒng)運(yùn)輸病毒無腫瘤特異性,大量病毒被運(yùn)輸至非腫瘤組織而難以發(fā)揮作用,最終能夠到達(dá)腫瘤位點(diǎn)的病毒非常有限。利用細(xì)胞作為運(yùn)載工具靶向運(yùn)輸基因治療載體的優(yōu)勢在于:1)基因治療載體裝載于載體細(xì)胞中,可以減少直接與體液環(huán)境相接觸,避免抗體中和作用。2)選擇對腫瘤病灶具有趨向性的細(xì)胞載體,可以幫助所裝載的病毒集中到達(dá)腫瘤病灶,減少因病毒感染健康組織而產(chǎn)生的病毒損失和毒副作用。3)用于病毒類基因治療載體運(yùn)輸?shù)募?xì)胞,同時(shí)可以作為病毒增殖的宿主,通過在載體細(xì)胞中的增殖作用,病毒釋放于腫瘤病灶的滴度得以大幅提高。Ad5/11嵌合型病毒是在目前基因治療常用的5型腺病毒的基礎(chǔ)上,將自身5型病毒Fiber結(jié)構(gòu)中的Konb和shaft區(qū)域替換成Ad11型病毒的Fiber結(jié)構(gòu),使得嵌合型病毒獲得11型腺病毒的感染特性,可以通過識別廣泛表達(dá)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子CD46感染細(xì)胞,既可感染上皮和間質(zhì)來源的腫瘤細(xì)胞,又可感染淋巴來源的免疫細(xì)胞,是用于免疫細(xì)胞運(yùn)載的理想載體�；谝陨显�,本課題的第二部分希望探討利用CIK細(xì)胞作為病毒載體的運(yùn)載工具,通過CIK細(xì)胞的腫瘤歸巢特性,將病毒攜帶至腫瘤位點(diǎn),解決彌撒生長或廣泛轉(zhuǎn)移的腫瘤患者的給藥難題。第一部分:研究表達(dá)IL-12的雙靶向溶瘤腺病毒聯(lián)合CIK細(xì)胞對肝癌的治療效果試驗(yàn)?zāi)康奶接慍IK細(xì)胞聯(lián)合表達(dá)IL-12的溶瘤腺病毒的體內(nèi)外抗腫瘤作用,分析其聯(lián)合抗腫瘤作用的機(jī)制,為“細(xì)胞-病毒-基因”聯(lián)合療法提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法1.利用細(xì)菌重組技術(shù),在課題組雙靶向性溶瘤病毒Ad CN205系統(tǒng)的基礎(chǔ)上構(gòu)建表達(dá)IL-12基因的腫瘤特異性溶瘤病毒Ad CN205-IL12;2.通過檢測溶瘤病毒Ad CN205-IL12在BEL7404、Hu H-7、SMMC7721等腫瘤細(xì)胞系和正常肝細(xì)胞AKN-1中的病毒復(fù)制能力,IL-12基因表達(dá)水平,來驗(yàn)證其腫瘤特異性;3.通過對比溶瘤病毒Ad CN205-IL12對腫瘤細(xì)胞BEL7404、Hu H-7、Hep3B和正常肝細(xì)胞AKN-1的體外殺傷作用,來驗(yàn)證其腫瘤靶向殺傷能力;4.采集健康志愿者外周血,通過淋巴細(xì)胞分離液分離得到PBMC細(xì)胞,在IFN-γ,OKT3,IL-2,IL-1等因子的共同刺激下培養(yǎng)獲得CIK細(xì)胞,通過流式細(xì)胞技術(shù)分析培養(yǎng)14天的細(xì)胞表面CD3、CD4、CD8、CD56、NKG2D等的表達(dá),鑒定細(xì)胞CIK細(xì)胞培養(yǎng)效果;5.通過表達(dá)熒光素酶的慢病毒載體p CDH-EF1α-Luciferase-2A-m Cherry構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Luciferase的靶細(xì)胞系,檢測CIK與溶瘤病毒聯(lián)合殺傷后靶細(xì)胞系Hu H-7和Hep3B中殘余Luciferase的酶活性,替代Cr51同位素釋放試驗(yàn)來研究CIK細(xì)胞聯(lián)合溶瘤病毒的體外殺傷效果;6.建立Hu H-7細(xì)胞系的SCID小鼠體外移植瘤模型,通過腫瘤局部注射溶瘤病毒(2×108PFU)聯(lián)合尾靜脈注射CIK細(xì)胞(1×107),測量腫瘤生長體積繪制腫瘤生長曲線和觀察小鼠存活情況繪制小鼠生存曲線來研究聯(lián)合治療效果,通過多因素方差分析和log-rank對數(shù)秩檢驗(yàn)來評價(jià)聯(lián)合治療的優(yōu)勢;7.通過免疫熒光觀察肝臟組織和腫瘤組織種GFP表達(dá)情況,Elisa檢測IL-12表達(dá)情況,以及通過免疫組化標(biāo)記病毒Hexon蛋白來研究外源基因表達(dá)及病毒復(fù)制的特異性;8.通過免疫組化標(biāo)記人CD3分子研究CIK細(xì)胞浸潤腫瘤組織的情況,通過免疫組化標(biāo)記CD34分子研究腫瘤血管密度,研究CIK聯(lián)合表達(dá)IL-12的溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.成功構(gòu)建表達(dá)人IL-12的雙靶向溶瘤腺病毒載體Ad CN205-IL12,該病毒用人端粒酶啟動(dòng)子代替病毒原有啟動(dòng)子來調(diào)節(jié)病毒復(fù)制;同時(shí)病毒E1A基因的CR2區(qū)刪除與RB蛋白相互作用的24bp序列使得病毒在正常細(xì)胞中復(fù)制受到限制;外源基因插入至E3區(qū)6.7k/gp19k位點(diǎn),且受到病毒E3區(qū)內(nèi)源性啟動(dòng)子的調(diào)控。2.該病毒在SMMC7721,BEL7404,MHCC97H,Hu H-7及Hep3B等肝癌細(xì)胞中的復(fù)制能力與各細(xì)胞系端粒酶表達(dá)水平相關(guān),說明病毒的復(fù)制受到端粒酶啟動(dòng)子的調(diào)節(jié),而在正常肝來源的細(xì)胞系中不能復(fù)制,說明病毒的復(fù)制具有腫瘤特異性。3.通過觀察Ad CN205-GFP病毒感染肝癌細(xì)胞系BEL7404和正常肝來源的細(xì)胞系A(chǔ)KN-1發(fā)現(xiàn)GFP基因在腫瘤細(xì)胞中表達(dá)量顯著高于正常肝來源的細(xì)胞;通過ELSIA檢測Ad CN205-IL12病毒感染肝癌細(xì)胞系BEL7404和正常肝來源的細(xì)胞系A(chǔ)KN-1后IL-12 P70的表達(dá)情況,結(jié)果顯示腫瘤細(xì)胞系中IL-12基因的表達(dá)水平顯著高于正常肝來源的細(xì)胞系,表明外源基因表達(dá)具有腫瘤特異性;4.通過對體外培養(yǎng)14天的CIK細(xì)胞進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示CD3陽性的T細(xì)胞占總細(xì)胞群體的94.05%±6.74%,CD3/CD4雙陽性的Th細(xì)胞占總細(xì)胞群體的12.13±1.58%,CD3/CD8陽性的CTL細(xì)胞占總細(xì)胞群體的69.2%±4.75%,CD3/CD56雙陽性的NKT細(xì)胞占總細(xì)胞群體的25.48±4.77%,CD3-/CD56+的NK細(xì)胞占總細(xì)胞的5.33%±4.32%,共有83.5±3.87%的細(xì)胞表達(dá)與腫瘤非特異殺傷相關(guān)的NKG2D分子。此結(jié)果與以往的報(bào)道的CIK細(xì)胞表型一致。5.Ad CN205-IL12和Ad CN205-GFP對腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的殺傷能力,但兩者之間無差異。說明IL-12基因不能提高溶瘤病毒的體外殺傷作用能力。表達(dá)IL-12的非復(fù)制型病毒Ad IL-12體外對腫瘤細(xì)胞也無殺傷作用。說明單純的IL-12對腫瘤細(xì)胞無直接殺傷效果。6.在效靶20:1的情況下,IL-12提升CIK細(xì)胞的體外抗腫瘤作用,由14.37%±2.24%提升至34.68%±1.78%,P=0.000553,在40:1的情況下抗腫瘤作用由51.50%±1.19%提升至70.23%±0.96%,p=0.001979,提示IL-12可以顯著提升CIK細(xì)胞對肝癌細(xì)胞的抑制作用;7.在效靶比10:1,病毒感染系數(shù)為10MOI的情況下,對于肝癌細(xì)胞系Hu H-7,在48h的時(shí)間點(diǎn),CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-GFP組較單CIK組,腫瘤細(xì)胞存活率降低,差異顯著(n=3,p=0.0260),CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組較單CIK組腫瘤細(xì)胞存活率降低,差異極顯著(n=3,p=0.0018);72h的時(shí)間點(diǎn)CIK聯(lián)合Ad CN205-IL12組較聯(lián)合Ad CN205-GFP組的腫瘤抑制作用更強(qiáng),差異顯著(n=3,p=0.0135);8.在效靶比10:1,病毒感染系數(shù)為10MOI的情況下,對于肝癌細(xì)胞系Hep3B,CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組較單CIK組腫瘤細(xì)胞存活率降低,差異極顯著(p=0.0001),較單獨(dú)Ad CN205-GFP組腫瘤細(xì)胞存活率降低,差異極顯著(p=0.00026),較單獨(dú)Ad CN205-IL12組腫瘤細(xì)胞存活率降低,差異極顯著(p=0.00032),較CIK聯(lián)合Ad CN205-GFP組腫瘤細(xì)胞存活率降低,差異極顯著(p=0.00027)。在72h的時(shí)間點(diǎn),CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-IL12病毒組較其他各組均有極顯著的抑制效果(P0.001)。提示CIK細(xì)胞聯(lián)合溶瘤病毒可提升對腫瘤細(xì)胞的抑制作用,表達(dá)IL-12基因可進(jìn)一步提升抗腫瘤效果。9.體內(nèi)移植瘤模型治療結(jié)果顯示,單一治療組(Ad CN205-GFP,Ad CN205-IL12,CIK)相對PBS組而言具有一定的腫瘤抑制效果,且差異極顯著(n=8,p0.001),但是單一治療組之間并無顯著差異。CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-GFP組較單一治療組Ad CN205-GFP(n=8,p=0.02)和CIK(n=8,p=0.008)具有顯著差異。CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組具有最強(qiáng)的抗腫瘤作用,其較所有單一治療組具有極顯著差異(n=8,p0.001),較CIK聯(lián)合Ad CN205-GFP組抗腫瘤效果更顯著(n=8,p=0.047)。治療過程中發(fā)現(xiàn),CIK細(xì)胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組中有2只小鼠腫瘤完全消失。10.在小鼠生存時(shí)間上,PBS組與其它各治療組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。但各治療組間差異不顯著。11.體內(nèi)移植瘤模型治療結(jié)果顯示,CIK聯(lián)合Ad CN205-IL12組,CIK聯(lián)合Ad CN205-GFP組,及單Ad CN205-GFP組的瘤組織出現(xiàn)大量壞死,而PBS組,CIK組及Ad CN205-IL2組壞死區(qū)域相對較少;CIK聯(lián)合Ad CN205-IL12組浸潤的人源CD3陽性的細(xì)胞數(shù)顯著高于其他組。說明IL-12可增強(qiáng)CIK細(xì)胞的浸潤或促進(jìn)CIK細(xì)胞在腫瘤細(xì)胞內(nèi)的增殖或存活;12.GFP或IL-12僅在腫瘤組織有表達(dá),而在肝臟組織中未檢測到GFP或IL-12的表達(dá),提升CIK聯(lián)合溶瘤病毒治療不影響外源基因在組織中表達(dá)的特異性。免疫組化的結(jié)果顯示病毒僅在腫瘤細(xì)胞中能夠檢測出來,而在正常肝臟中檢測不到病毒Hexon的存在,提示CIK聯(lián)合病毒治療不影響病毒復(fù)制的特異性。結(jié)論CIK細(xì)胞聯(lián)合表達(dá)IL-12基因的雙靶向性溶瘤病毒Ad CN205-IL12具有協(xié)同抗腫瘤作用,發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒的腫瘤裂解作用和腫瘤局部高濃度IL-12的表達(dá)增加了CIK細(xì)胞在腫瘤組織內(nèi)的浸潤數(shù)量,增強(qiáng)了CIK細(xì)胞的抗腫瘤作用,實(shí)現(xiàn)了“細(xì)胞-病毒-基因”強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合的治療效果。第二部分:CIK細(xì)胞運(yùn)載Ad5/11嵌合型病毒靶向肝癌治療的機(jī)制研究試驗(yàn)?zāi)康尼槍Ω伟⿵浫錾L或廣泛轉(zhuǎn)移的特性,探討CIK細(xì)胞運(yùn)載Ad5/11嵌合型病毒實(shí)現(xiàn)血液系統(tǒng)給藥的可行性,并研究病毒轉(zhuǎn)載及轉(zhuǎn)移的相關(guān)機(jī)制。實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及方法1.流式細(xì)胞技術(shù)檢測CIK細(xì)胞表面CAR、αvβ5、αvβ3、CD46分子的表達(dá)情況;通過Ad5-CMV-GFP病毒感染CIK細(xì)胞,并檢測細(xì)胞GFP陽性率研究5型病毒對CIK細(xì)胞的感染情況;2.通過Ad5-CMV-GFP-11F嵌合病毒感染CIK細(xì)胞檢測細(xì)胞GFP陽性率研究Ad5/11型病毒對CIK細(xì)胞的感染能力;通過Texsa Red標(biāo)記病毒于激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒結(jié)合CIK細(xì)胞的能力;3.通過Texas Red標(biāo)記病毒,FITC標(biāo)記CD46分子,研究病毒感染CIK細(xì)胞的過程與CD46分子的相關(guān)性;4.通過體外模擬CIK細(xì)胞在血液運(yùn)輸過程中受到的剪切作用,病毒感染CIK細(xì)胞后,通過10倍體積的PBS洗滌,再將洗滌后的CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng),觀察病毒轉(zhuǎn)移情況;5.通過CIK細(xì)胞攜帶Ad CN205系統(tǒng)的溶瘤腺病毒,研究經(jīng)CIK細(xì)胞攜帶的病毒是否保持感染、增殖和基因表達(dá)活力,以及體外抗腫瘤能力;體外檢測CIK攜帶溶瘤病毒對肝癌Hu H-7細(xì)胞和PLC/RPF/5細(xì)胞的殺傷作用;6.通過Di O標(biāo)記CIK細(xì)胞膜,Texsa Red標(biāo)記病毒于激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒由CIK細(xì)胞轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞的過程;研究病毒轉(zhuǎn)移過程與細(xì)胞膜的相關(guān)作用的關(guān)系;7.通過細(xì)胞松弛素D抑制細(xì)胞骨架運(yùn)動(dòng),研究病毒轉(zhuǎn)移過程與病毒骨架的運(yùn)動(dòng)的相關(guān)性;實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.CIK細(xì)胞表面不表達(dá)CAR、αvβ5、αvβ3等與5型腺病毒感染相關(guān)的受體分子,而大量表達(dá)與11型腺病毒感染細(xì)胞相關(guān)的補(bǔ)體調(diào)節(jié)分子CD46受體;且5型腺病毒無法感染和吸附CIK細(xì)胞;2.Ad5/11嵌合型腺病毒可吸附于CIK細(xì)胞表面,在100MOI感染系數(shù)下對CIK細(xì)胞的感染效率可達(dá)到45.2±3.4%;Ad5/11嵌合型腺病毒可感染上皮來源的腫瘤細(xì)胞,感染效率與Ad5型病毒無差異;3.Ad5/11嵌合型腺病毒可在細(xì)胞表面引起極化作用,但病毒進(jìn)入CIK細(xì)胞的能力有限;4.裝載Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞共培養(yǎng)后,病毒可由CIK細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞;5.CIK可攜帶Ad5/11嵌合型瘤腺病毒并將病毒轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞,并保持溶瘤病毒的殺傷活性,對于Hu H-7細(xì)胞,72h時(shí)CIK細(xì)胞攜帶Ad CN205-GFP-11F組腫瘤細(xì)胞存活率顯著低于單CIK組(p=0.0008),和CIK攜帶Ad CN205-GFP組(p=0.0168);對于PLC/RPF/5細(xì)胞,72h時(shí)CIK細(xì)胞攜帶Ad CN205-GFP-11F組PLC/PRF/5細(xì)胞存活率顯著低于單CIK組(p㩳0.0001),和CIK攜帶Ad CN205-GFP組(p=0.005);6.Ad5/11嵌合型腺病毒由CIK細(xì)胞表面轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞依賴于CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞間膜的相互作用;7.通過細(xì)胞松弛素D抑制細(xì)胞骨架的運(yùn)動(dòng)可抑制病毒的轉(zhuǎn)移過程;結(jié)論Ad5/11嵌合型腺病毒可感染和吸附CIK細(xì)胞,攜帶Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK細(xì)胞通過CIK細(xì)胞與腫瘤細(xì)胞膜之間的相互作用將病毒轉(zhuǎn)移至腫瘤細(xì)胞中,并保持病毒的生物學(xué)活性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1505083