本文關鍵詞： 過繼免疫細胞治療 基因治療 溶瘤腺病毒 IL-12基因 Ad5/11嵌合型腺病毒 細胞運輸載體 細胞膜交換 病毒轉移　出處：《第三軍醫(yī)大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率居高不下,嚴重危害人類健康,傳統(tǒng)治療方法對中晚期患者療效非常有限,臨床上亟待研究更為有效的治療方法。生物治療中的免疫細胞治療和基因治療近年來發(fā)展迅速,接連在技術和療效上取得突破,受到廣泛關注。免疫細胞治療中的過繼免疫療法(adoptive cell therapy)已在臨床廣泛應用并取得一定的治療效果。然而由于肝癌瘤內腫瘤微環(huán)境相對復雜,細胞浸潤不足,且浸潤的免疫細胞無法發(fā)揮腫瘤殺傷作用,而且在這些免疫抑制信號的作用下效應細胞大量死亡或衰竭。因此如何突破腫瘤微環(huán)境的限制,提高免疫治療的效果是目前研究的熱點和難點。溶瘤病毒介導的基因治療(“病毒-基因”治療)是基因治療中的一個新策略,利用溶瘤病毒在腫瘤組織中不斷復制和再感染作用,可最大程度地感染腫瘤細胞,并長期維持基因的表達。同時研究發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒在感染和裂解腫瘤細胞后能產生“危險”信號、釋放Ⅰ型干擾素并暴露腫瘤抗原。腫瘤內的抗原遞呈細胞通過模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)識別危險信號,并遞呈腫瘤抗原,可引發(fā)宿主產生針對腫瘤的免疫反應。利用溶瘤病毒載體大量表達免疫活化因子或抑制性受體的阻斷劑,可進一步解除腫瘤免疫抑制,增強抗腫瘤的免疫反應作用。IL-12是一種重要的免疫活化因子,其可直接作用于T淋巴細胞和NK細胞,在天然免疫反應和過繼免疫反應中扮演重要的角色。IL-12除了直接作用于免疫系統(tǒng)促進免疫活化外,還能夠誘導血管內皮細胞上調表達內皮粘附分子對引導T淋巴細胞浸潤至腫瘤組織具有促進作用�；谝陨显�,本課題的第一部分希望探討將“細胞過繼免疫療法”與“病毒-基因”療法進行聯(lián)合的可行性。一方面通過“病毒-基因”療法向腫瘤病灶直接注射表達免疫活化基因IL-12的溶瘤腺病毒,利用病毒的溶瘤作用和腫瘤局部表達高濃度的IL-12因子,打破腫瘤免疫抑制微環(huán)境,產生急性炎癥環(huán)境。另一方面通過外源輸注過繼免疫細胞CIK,使外源的免疫細胞在急性炎癥環(huán)境下更好的發(fā)揮抗腫瘤作用。實現(xiàn)“細胞-病毒-基因”強強聯(lián)合的治療效果。雖然“病毒-基因”療法具有諸多優(yōu)點,顯示出廣泛的治療前景,然而受到藥物輸注方式的制約,限制其適應癥范圍。1)腫瘤局部注射,即將藥物直接注射到腫瘤組織。這種給藥方法病毒能最大限度地到達腫瘤組織。但這種方式對部分患者損傷較大,需要手術配合,具有風險,且惡性腫瘤多呈彌散性生長或廣泛轉移,難以實現(xiàn)原位直接注射。2)脈管系統(tǒng)輸注,該方法操作相對簡單,藥物能夠通過血液系統(tǒng)運輸至各個組織器官,解決彌散性轉移難題。然而病毒類藥物直接暴露于血液系統(tǒng)中,病毒將被血管內皮細胞和血細胞大量非特異吸附,或被抗體中和失去感染能力。加之血液系統(tǒng)運輸病毒無腫瘤特異性,大量病毒被運輸至非腫瘤組織而難以發(fā)揮作用,最終能夠到達腫瘤位點的病毒非常有限。利用細胞作為運載工具靶向運輸基因治療載體的優(yōu)勢在于:1)基因治療載體裝載于載體細胞中,可以減少直接與體液環(huán)境相接觸,避免抗體中和作用。2)選擇對腫瘤病灶具有趨向性的細胞載體,可以幫助所裝載的病毒集中到達腫瘤病灶,減少因病毒感染健康組織而產生的病毒損失和毒副作用。3)用于病毒類基因治療載體運輸?shù)募毎?同時可以作為病毒增殖的宿主,通過在載體細胞中的增殖作用,病毒釋放于腫瘤病灶的滴度得以大幅提高。Ad5/11嵌合型病毒是在目前基因治療常用的5型腺病毒的基礎上,將自身5型病毒Fiber結構中的Konb和shaft區(qū)域替換成Ad11型病毒的Fiber結構,使得嵌合型病毒獲得11型腺病毒的感染特性,可以通過識別廣泛表達的補體調節(jié)分子CD46感染細胞,既可感染上皮和間質來源的腫瘤細胞,又可感染淋巴來源的免疫細胞,是用于免疫細胞運載的理想載體�；谝陨显�,本課題的第二部分希望探討利用CIK細胞作為病毒載體的運載工具,通過CIK細胞的腫瘤歸巢特性,將病毒攜帶至腫瘤位點,解決彌撒生長或廣泛轉移的腫瘤患者的給藥難題。第一部分:研究表達IL-12的雙靶向溶瘤腺病毒聯(lián)合CIK細胞對肝癌的治療效果試驗目的探討CIK細胞聯(lián)合表達IL-12的溶瘤腺病毒的體內外抗腫瘤作用,分析其聯(lián)合抗腫瘤作用的機制,為“細胞-病毒-基因”聯(lián)合療法提供實驗基礎。實驗內容及方法1.利用細菌重組技術,在課題組雙靶向性溶瘤病毒Ad CN205系統(tǒng)的基礎上構建表達IL-12基因的腫瘤特異性溶瘤病毒Ad CN205-IL12;2.通過檢測溶瘤病毒Ad CN205-IL12在BEL7404、Hu H-7、SMMC7721等腫瘤細胞系和正常肝細胞AKN-1中的病毒復制能力,IL-12基因表達水平,來驗證其腫瘤特異性;3.通過對比溶瘤病毒Ad CN205-IL12對腫瘤細胞BEL7404、Hu H-7、Hep3B和正常肝細胞AKN-1的體外殺傷作用,來驗證其腫瘤靶向殺傷能力;4.采集健康志愿者外周血,通過淋巴細胞分離液分離得到PBMC細胞,在IFN-γ,OKT3,IL-2,IL-1等因子的共同刺激下培養(yǎng)獲得CIK細胞,通過流式細胞技術分析培養(yǎng)14天的細胞表面CD3、CD4、CD8、CD56、NKG2D等的表達,鑒定細胞CIK細胞培養(yǎng)效果;5.通過表達熒光素酶的慢病毒載體p CDH-EF1α-Luciferase-2A-m Cherry構建穩(wěn)定表達Luciferase的靶細胞系,檢測CIK與溶瘤病毒聯(lián)合殺傷后靶細胞系Hu H-7和Hep3B中殘余Luciferase的酶活性,替代Cr51同位素釋放試驗來研究CIK細胞聯(lián)合溶瘤病毒的體外殺傷效果;6.建立Hu H-7細胞系的SCID小鼠體外移植瘤模型,通過腫瘤局部注射溶瘤病毒(2×108PFU)聯(lián)合尾靜脈注射CIK細胞(1×107),測量腫瘤生長體積繪制腫瘤生長曲線和觀察小鼠存活情況繪制小鼠生存曲線來研究聯(lián)合治療效果,通過多因素方差分析和log-rank對數(shù)秩檢驗來評價聯(lián)合治療的優(yōu)勢;7.通過免疫熒光觀察肝臟組織和腫瘤組織種GFP表達情況,Elisa檢測IL-12表達情況,以及通過免疫組化標記病毒Hexon蛋白來研究外源基因表達及病毒復制的特異性;8.通過免疫組化標記人CD3分子研究CIK細胞浸潤腫瘤組織的情況,通過免疫組化標記CD34分子研究腫瘤血管密度,研究CIK聯(lián)合表達IL-12的溶瘤腺病毒的抗腫瘤作用機制。實驗結果1.成功構建表達人IL-12的雙靶向溶瘤腺病毒載體Ad CN205-IL12,該病毒用人端粒酶啟動子代替病毒原有啟動子來調節(jié)病毒復制;同時病毒E1A基因的CR2區(qū)刪除與RB蛋白相互作用的24bp序列使得病毒在正常細胞中復制受到限制;外源基因插入至E3區(qū)6.7k/gp19k位點,且受到病毒E3區(qū)內源性啟動子的調控。2.該病毒在SMMC7721,BEL7404,MHCC97H,Hu H-7及Hep3B等肝癌細胞中的復制能力與各細胞系端粒酶表達水平相關,說明病毒的復制受到端粒酶啟動子的調節(jié),而在正常肝來源的細胞系中不能復制,說明病毒的復制具有腫瘤特異性。3.通過觀察Ad CN205-GFP病毒感染肝癌細胞系BEL7404和正常肝來源的細胞系AKN-1發(fā)現(xiàn)GFP基因在腫瘤細胞中表達量顯著高于正常肝來源的細胞;通過ELSIA檢測Ad CN205-IL12病毒感染肝癌細胞系BEL7404和正常肝來源的細胞系AKN-1后IL-12 P70的表達情況,結果顯示腫瘤細胞系中IL-12基因的表達水平顯著高于正常肝來源的細胞系,表明外源基因表達具有腫瘤特異性;4.通過對體外培養(yǎng)14天的CIK細胞進行檢測,結果顯示CD3陽性的T細胞占總細胞群體的94.05%±6.74%,CD3/CD4雙陽性的Th細胞占總細胞群體的12.13±1.58%,CD3/CD8陽性的CTL細胞占總細胞群體的69.2%±4.75%,CD3/CD56雙陽性的NKT細胞占總細胞群體的25.48±4.77%,CD3-/CD56+的NK細胞占總細胞的5.33%±4.32%,共有83.5±3.87%的細胞表達與腫瘤非特異殺傷相關的NKG2D分子。此結果與以往的報道的CIK細胞表型一致。5.Ad CN205-IL12和Ad CN205-GFP對腫瘤細胞具有較強的殺傷能力,但兩者之間無差異。說明IL-12基因不能提高溶瘤病毒的體外殺傷作用能力。表達IL-12的非復制型病毒Ad IL-12體外對腫瘤細胞也無殺傷作用。說明單純的IL-12對腫瘤細胞無直接殺傷效果。6.在效靶20:1的情況下,IL-12提升CIK細胞的體外抗腫瘤作用,由14.37%±2.24%提升至34.68%±1.78%,P=0.000553,在40:1的情況下抗腫瘤作用由51.50%±1.19%提升至70.23%±0.96%,p=0.001979,提示IL-12可以顯著提升CIK細胞對肝癌細胞的抑制作用;7.在效靶比10:1,病毒感染系數(shù)為10MOI的情況下,對于肝癌細胞系Hu H-7,在48h的時間點,CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-GFP組較單CIK組,腫瘤細胞存活率降低,差異顯著(n=3,p=0.0260),CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組較單CIK組腫瘤細胞存活率降低,差異極顯著(n=3,p=0.0018);72h的時間點CIK聯(lián)合Ad CN205-IL12組較聯(lián)合Ad CN205-GFP組的腫瘤抑制作用更強,差異顯著(n=3,p=0.0135);8.在效靶比10:1,病毒感染系數(shù)為10MOI的情況下,對于肝癌細胞系Hep3B,CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組較單CIK組腫瘤細胞存活率降低,差異極顯著(p=0.0001),較單獨Ad CN205-GFP組腫瘤細胞存活率降低,差異極顯著(p=0.00026),較單獨Ad CN205-IL12組腫瘤細胞存活率降低,差異極顯著(p=0.00032),較CIK聯(lián)合Ad CN205-GFP組腫瘤細胞存活率降低,差異極顯著(p=0.00027)。在72h的時間點,CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-IL12病毒組較其他各組均有極顯著的抑制效果(P0.001)。提示CIK細胞聯(lián)合溶瘤病毒可提升對腫瘤細胞的抑制作用,表達IL-12基因可進一步提升抗腫瘤效果。9.體內移植瘤模型治療結果顯示,單一治療組(Ad CN205-GFP,Ad CN205-IL12,CIK)相對PBS組而言具有一定的腫瘤抑制效果,且差異極顯著(n=8,p0.001),但是單一治療組之間并無顯著差異。CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-GFP組較單一治療組Ad CN205-GFP(n=8,p=0.02)和CIK(n=8,p=0.008)具有顯著差異。CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組具有最強的抗腫瘤作用,其較所有單一治療組具有極顯著差異(n=8,p0.001),較CIK聯(lián)合Ad CN205-GFP組抗腫瘤效果更顯著(n=8,p=0.047)。治療過程中發(fā)現(xiàn),CIK細胞聯(lián)合Ad CN205-IL12組中有2只小鼠腫瘤完全消失。10.在小鼠生存時間上,PBS組與其它各治療組間均有統(tǒng)計學差異。但各治療組間差異不顯著。11.體內移植瘤模型治療結果顯示,CIK聯(lián)合Ad CN205-IL12組,CIK聯(lián)合Ad CN205-GFP組,及單Ad CN205-GFP組的瘤組織出現(xiàn)大量壞死,而PBS組,CIK組及Ad CN205-IL2組壞死區(qū)域相對較少;CIK聯(lián)合Ad CN205-IL12組浸潤的人源CD3陽性的細胞數(shù)顯著高于其他組。說明IL-12可增強CIK細胞的浸潤或促進CIK細胞在腫瘤細胞內的增殖或存活;12.GFP或IL-12僅在腫瘤組織有表達,而在肝臟組織中未檢測到GFP或IL-12的表達,提升CIK聯(lián)合溶瘤病毒治療不影響外源基因在組織中表達的特異性。免疫組化的結果顯示病毒僅在腫瘤細胞中能夠檢測出來,而在正常肝臟中檢測不到病毒Hexon的存在,提示CIK聯(lián)合病毒治療不影響病毒復制的特異性。結論CIK細胞聯(lián)合表達IL-12基因的雙靶向性溶瘤病毒Ad CN205-IL12具有協(xié)同抗腫瘤作用,發(fā)現(xiàn)溶瘤病毒的腫瘤裂解作用和腫瘤局部高濃度IL-12的表達增加了CIK細胞在腫瘤組織內的浸潤數(shù)量,增強了CIK細胞的抗腫瘤作用,實現(xiàn)了“細胞-病毒-基因”強強聯(lián)合的治療效果。第二部分:CIK細胞運載Ad5/11嵌合型病毒靶向肝癌治療的機制研究試驗目的針對肝癌彌撒生長或廣泛轉移的特性,探討CIK細胞運載Ad5/11嵌合型病毒實現(xiàn)血液系統(tǒng)給藥的可行性,并研究病毒轉載及轉移的相關機制。實驗內容及方法1.流式細胞技術檢測CIK細胞表面CAR、αvβ5、αvβ3、CD46分子的表達情況;通過Ad5-CMV-GFP病毒感染CIK細胞,并檢測細胞GFP陽性率研究5型病毒對CIK細胞的感染情況;2.通過Ad5-CMV-GFP-11F嵌合病毒感染CIK細胞檢測細胞GFP陽性率研究Ad5/11型病毒對CIK細胞的感染能力;通過Texsa Red標記病毒于激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒結合CIK細胞的能力;3.通過Texas Red標記病毒,FITC標記CD46分子,研究病毒感染CIK細胞的過程與CD46分子的相關性;4.通過體外模擬CIK細胞在血液運輸過程中受到的剪切作用,病毒感染CIK細胞后,通過10倍體積的PBS洗滌,再將洗滌后的CIK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng),觀察病毒轉移情況;5.通過CIK細胞攜帶Ad CN205系統(tǒng)的溶瘤腺病毒,研究經CIK細胞攜帶的病毒是否保持感染、增殖和基因表達活力,以及體外抗腫瘤能力;體外檢測CIK攜帶溶瘤病毒對肝癌Hu H-7細胞和PLC/RPF/5細胞的殺傷作用;6.通過Di O標記CIK細胞膜,Texsa Red標記病毒于激光共聚焦顯微鏡下觀察病毒由CIK細胞轉移至腫瘤細胞的過程;研究病毒轉移過程與細胞膜的相關作用的關系;7.通過細胞松弛素D抑制細胞骨架運動,研究病毒轉移過程與病毒骨架的運動的相關性;實驗結果1.CIK細胞表面不表達CAR、αvβ5、αvβ3等與5型腺病毒感染相關的受體分子,而大量表達與11型腺病毒感染細胞相關的補體調節(jié)分子CD46受體;且5型腺病毒無法感染和吸附CIK細胞;2.Ad5/11嵌合型腺病毒可吸附于CIK細胞表面,在100MOI感染系數(shù)下對CIK細胞的感染效率可達到45.2±3.4%;Ad5/11嵌合型腺病毒可感染上皮來源的腫瘤細胞,感染效率與Ad5型病毒無差異;3.Ad5/11嵌合型腺病毒可在細胞表面引起極化作用,但病毒進入CIK細胞的能力有限;4.裝載Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK細胞與腫瘤細胞共培養(yǎng)后,病毒可由CIK細胞表面轉移至腫瘤細胞;5.CIK可攜帶Ad5/11嵌合型瘤腺病毒并將病毒轉移至腫瘤細胞,并保持溶瘤病毒的殺傷活性,對于Hu H-7細胞,72h時CIK細胞攜帶Ad CN205-GFP-11F組腫瘤細胞存活率顯著低于單CIK組(p=0.0008),和CIK攜帶Ad CN205-GFP組(p=0.0168);對于PLC/RPF/5細胞,72h時CIK細胞攜帶Ad CN205-GFP-11F組PLC/PRF/5細胞存活率顯著低于單CIK組(p㩳0.0001),和CIK攜帶Ad CN205-GFP組(p=0.005);6.Ad5/11嵌合型腺病毒由CIK細胞表面轉移至腫瘤細胞依賴于CIK細胞與腫瘤細胞間膜的相互作用;7.通過細胞松弛素D抑制細胞骨架的運動可抑制病毒的轉移過程;結論Ad5/11嵌合型腺病毒可感染和吸附CIK細胞,攜帶Ad5/11嵌合型腺病毒的CIK細胞通過CIK細胞與腫瘤細胞膜之間的相互作用將病毒轉移至腫瘤細胞中,并保持病毒的生物學活性。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1505083