發(fā)布時(shí)間：2018-02-11 16:42

  本文關(guān)鍵詞： 乳酸菌胞外多糖 HT-29細(xì)胞 氧化應(yīng)激 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 凋亡　出處：《哈爾濱工業(yè)大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：結(jié)腸癌是人類高發(fā)惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅人類健康,結(jié)腸癌的有效防治已經(jīng)成為全球關(guān)注的熱點(diǎn)。結(jié)腸癌的發(fā)病與飲食、遺傳、運(yùn)動(dòng)不足、吸煙飲酒及慢性結(jié)腸直腸疾病等多種因素有關(guān),其中飲食是最重要的影響因素。乳酸菌胞外多糖被證實(shí)具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤等生物活性,但是對(duì)于乳酸菌胞外多糖誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞凋亡的相關(guān)機(jī)制很少報(bào)道。因此,本課題采用實(shí)驗(yàn)室自行分離得到的副干酪乳桿菌Lactobacillus paracasei subp.paracasei M5(L.paracasei M5),發(fā)酵提取胞外多糖,并通過(guò)與結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞共同培養(yǎng)來(lái)研究其誘導(dǎo)結(jié)腸癌HT-29細(xì)胞凋亡的作用及機(jī)制。(1)提取由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定得到的Lactobacillus paracasei subp.paracasei M5,Lactobacillus paracasei subp.paracasei X12,Lactobacillus coryniformis subp.torquens T3等三株乳酸菌的胞外多糖,通過(guò)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知Lactobacillus paracasei subp.paracasei M5胞外多糖(M5-EPS)的抑制作用最佳,用于后續(xù)研究;500μg/m L和1000μg/m L的M5-EPS作用于HT-29細(xì)胞48 h時(shí)抑制效果最好;隨后將M5-EPS的發(fā)酵條件進(jìn)行優(yōu)化,當(dāng)p H值為6.5,菌液濃度為108 CFU/m L,發(fā)酵溫度為37°C,發(fā)酵時(shí)間為12 h時(shí),最終得到的M5-EPS量最多;倒置顯微鏡下直接觀察M5-EPS處理后的HT-29細(xì)胞,與對(duì)照組相比,數(shù)目明顯減少,說(shuō)明M5-EPS可明顯抑制HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng);Hoechst 33258熒光染料對(duì)HT-29細(xì)胞進(jìn)行染色發(fā)現(xiàn)M5-EPS可以導(dǎo)致HT-29細(xì)胞形態(tài)變化;通過(guò)透射電鏡觀察M5-EPS處理之后HT-29細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu),結(jié)果顯示HT-29細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的凋亡特征,如細(xì)胞質(zhì)不均勻,內(nèi)部細(xì)胞器紊亂,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)發(fā)生了嚴(yán)重的腫脹;最后,通過(guò)流式細(xì)胞儀測(cè)定HT-29細(xì)胞的周期,表明M5-EPS可通過(guò)G0/G1的阻滯起到抑制細(xì)胞增殖的作用。(2)M5-EPS可以破壞HT-29細(xì)胞內(nèi)部氧化系統(tǒng)的平衡:采用熒光標(biāo)記法以及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)HT-29細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive oxygen species,ROS)水平,結(jié)果顯示和對(duì)照組相比,M5-EPS處理組可明顯的提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平,且呈現(xiàn)濃度依賴性;從基因角度,通過(guò)RT-PCR的手段得知M5-EPS可以顯著的降低HT-29細(xì)胞內(nèi)SOD、CAT和GSH-PX等抗氧化酶基因表達(dá)水平;從蛋白水平檢測(cè)SOD、CAT和GSH-PX等酶活力,最終結(jié)果與PCR結(jié)果相一致;通過(guò)N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)抑制細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激后,倒置顯微鏡下觀察,與M5-EPS直接處理相比,可以明顯增加HT-29細(xì)胞數(shù)目,細(xì)胞生長(zhǎng)形態(tài)良好。綜上所述,氧化應(yīng)激途徑參與M5-EPS誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡的過(guò)程,通過(guò)提高HT-29細(xì)胞ROS水平,并降低抗氧化酶活性致使細(xì)胞氧化系統(tǒng)失衡來(lái)抑制HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng)。(3)M5-EPS可以通過(guò)激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑,影響HT-29細(xì)胞的生長(zhǎng):流式細(xì)胞儀檢測(cè)M5-EPS處理后,HT-29細(xì)胞內(nèi)鈣網(wǎng)蛋白(CRT)量增加,這說(shuō)明可能啟動(dòng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激通路;M5-EPS可以顯著的提高HT-29細(xì)胞內(nèi)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激因子GRP78、ATF4和CHOP m RNA的表達(dá)量,且基本呈現(xiàn)濃度依賴性;測(cè)定與凋亡相關(guān)的因子,結(jié)果顯示M5-EPS能夠顯著的提高促凋亡因子caspase-3、Bax和Bad基因的表達(dá),顯著降低抗凋亡因子Bcl-xl基因的表達(dá);經(jīng)過(guò)NAC處理后,檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)ROS的變化,與M5-EPS直接處理相比熒光強(qiáng)度明顯降低,說(shuō)明氧化應(yīng)激途徑受到抑制;RT-PCR法檢測(cè)氧化應(yīng)激途徑抑制之后細(xì)胞內(nèi)GRP78和CHOP m RNA的表達(dá)量,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)因子表達(dá)量都顯著降低,表明氧化應(yīng)激可以影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激途徑的激活。
[Abstract]:Colon cancer is one of the most important malignant tumors in the world . The effective prevention and cure of colon cancer has become the focus of global attention . The pathogenesis of colon cancer is related to diet , inheritance , lack of exercise , smoking and alcohol consumption and chronic colon rectal disease . The results showed that M5 - EPS inhibited the growth of HT - 29 cells . The results showed that M5 - EPS inhibited the growth of HT - 29 cells . ( 2 ) M5 - EPS could destroy the equilibrium of the internal oxidation system of HT - 29 cells : the levels of reactive oxygen species ( ROS ) in HT - 29 cells were detected by fluorescence labeling and flow cytometry . The results showed that the levels of SOD , CAT and GSH - PX in HT - 29 cells were significantly decreased compared with the control group . ( 3 ) M5 - EPS could stimulate the growth of HT - 29 cells by activating the endoplasmic reticulum stress pathway : the amount of intracellular calcium net protein ( CRT ) increased in HT - 29 cells after M5 - EPS was detected by flow cytometry .

【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉翠平;葉蕾;吳正鈞;王蔭榆;郭本恒;;干酪乳桿菌LC2W胞外多糖提取工藝研究[J];華北農(nóng)學(xué)報(bào);2008年S2期

2 劉宇;孟祥晨;;乳酸菌胞外多糖及其抗腫瘤活性[J];中國(guó)乳品工業(yè);2008年01期

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本文編號(hào)：1503518