本文關(guān)鍵詞： SIFγ 質(zhì)粒構(gòu)建 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 慢病毒 感染 MTT 細(xì)胞活性 腫瘤細(xì)胞侵襲 替莫唑胺 雙熒光素酶 IFNγ調(diào)節(jié)基因 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：人腦惡性膠質(zhì)瘤是顱內(nèi)原發(fā)性腫瘤中發(fā)病率最高的惡性腫瘤,由于其具有惡性程度高和侵襲能力強(qiáng)的特點(diǎn),因此臨床治愈困難、預(yù)后差、病變致死率高。據(jù)統(tǒng)計(jì),經(jīng)過綜合治療后惡性腦膠質(zhì)瘤患者的存活中位數(shù)時(shí)間僅為15個(gè)月1。目前治療惡性腦膠質(zhì)瘤的標(biāo)準(zhǔn)方法主要包括外科切除,放射治療,化學(xué)藥物治療或者這幾種治療方法的聯(lián)合使用2,這些治療措施在一定程度上抑制了腫瘤的生長,延長了患者的生命,但是這些方法終究不能徹底消滅腫瘤細(xì)胞,并且惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性程度高,侵襲能力強(qiáng),即使經(jīng)過上述綜合治療,往往還是容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移,造成預(yù)后效果不佳。因此尋找一種新的方法輔助治療惡性膠質(zhì)瘤,提高治療預(yù)后效果是非常必要的。γ-干擾素自發(fā)現(xiàn)以來備受關(guān)注,由于其具有多種生物活性,因此受到科學(xué)家的青睞,它的生物活性包含抑制腫瘤生長和免疫調(diào)節(jié)的作用,這些活性作用給腫瘤研究人員尋找抑制腫瘤生長試劑提供了一個(gè)理想的選擇。經(jīng)過多年的研究發(fā)現(xiàn)γ-干擾素能夠直接抑制腫瘤細(xì)胞分化并且通過增強(qiáng)機(jī)體對(duì)腫瘤細(xì)胞的免疫應(yīng)答從而間接抑制腫瘤的進(jìn)展,目前作為一種輔助制劑被廣泛應(yīng)用于臨床治療癌癥患者3、4、5。但是在臨床使用過程中發(fā)現(xiàn)γ-干擾素的半衰期太短,有實(shí)驗(yàn)報(bào)道在人體內(nèi)經(jīng)靜脈注射的γ-干擾素半衰期時(shí)間大約為30分鐘,經(jīng)肌肉注射其半衰期時(shí)間大約為4.5小時(shí),通過γ-干擾素基因治療可以維持血漿內(nèi)γ-干擾素的濃度,但是γ-干擾素受體在體內(nèi)的廣泛表達(dá)限制了其特異性治療作用,造成了抗腫瘤作用的低效性,但是控制γ-干擾素在組織內(nèi)的分布可以部分解決這一問題6、7。因此重新設(shè)計(jì)一種γ-干擾素融合蛋白減少其細(xì)胞毒性引起的副作用,增強(qiáng)其抑制腫瘤細(xì)胞增殖的能力是目前可行的方法。在本實(shí)驗(yàn)中,我們在原始γ-干擾素DNA序列的3’端添加一段來自于胎盤生長因子的正電荷多肽以形成新的γ-干擾素融合蛋白DNA序列,該融合蛋白我們稱之為合成的γ-干擾素(Synthetic Interferonγ,SIFγ)。為了驗(yàn)證新合成的融合蛋白對(duì)惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響,我們將該融合蛋白的表達(dá)質(zhì)粒聯(lián)合包裝質(zhì)粒和信封質(zhì)粒共同瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞,收集293T細(xì)胞產(chǎn)生的慢病毒,使用慢病毒感染至人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87細(xì)胞系,然后通過嘌呤霉素篩選出穩(wěn)定表達(dá)新合成的γ-干擾素融合蛋白的U87細(xì)胞系,進(jìn)行腫瘤細(xì)胞的各項(xiàng)效應(yīng)實(shí)驗(yàn),與對(duì)照組相比較,從而研究該正電荷多肽片段是否能夠增強(qiáng)野生型γ-干擾素抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的作用,并且檢測γ-干擾素下游通路各干擾素調(diào)節(jié)基因的表達(dá)狀況,這些研究為新合成的γ-干擾素在腫瘤抑制方面的應(yīng)用提供了一個(gè)有效可行的方向。本實(shí)驗(yàn)主要包含以下三個(gè)部分。第一部分SIFγ質(zhì)粒的構(gòu)建及其在U87細(xì)胞系內(nèi)表達(dá)的研究目的:構(gòu)建SIFγ表達(dá)質(zhì)粒并且研究其在人腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的可行性。方法:通過RT-PCR方法獲得γ-干擾素cDNA和胎盤生長因子內(nèi)正電荷多肽DNA編碼序列,用PCR方法將兩者連接起來,通過分子克隆方法將其連接在含有綠色熒光蛋白和嘌呤霉素雙選擇標(biāo)記的表達(dá)質(zhì)粒內(nèi),擴(kuò)增后通過酶切鑒定。將驗(yàn)證正確的SIFγ質(zhì)粒聯(lián)合包裝質(zhì)粒和信封質(zhì)粒采用脂質(zhì)體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的方法共轉(zhuǎn)染至293T細(xì)胞進(jìn)行慢病毒包裝,收集濃縮產(chǎn)生的SIFγ慢病毒顆粒感染U87細(xì)胞,通過內(nèi)置的雙選擇標(biāo)記篩選出穩(wěn)定表達(dá)SIFγ的U87細(xì)胞。并且設(shè)置相應(yīng)的對(duì)照組,采用相同的方法獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染相應(yīng)質(zhì)粒的U87細(xì)胞,為后續(xù)實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。結(jié)果:成功構(gòu)建了SIFγ表達(dá)質(zhì)粒,并且篩選出穩(wěn)定表達(dá)SIFγ的U87細(xì)胞系。結(jié)論:新構(gòu)建的SIFγ表達(dá)質(zhì)粒能夠在U87細(xì)胞系內(nèi)穩(wěn)定表達(dá),為下一步研究在腦惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)SIFγ對(duì)細(xì)胞增殖的影響奠定了基礎(chǔ)。第二部分SIFγ對(duì)U87細(xì)胞增殖活性的影響目的:研究SIFγ對(duì)U87細(xì)胞系增殖活性的影響,并且觀察SIFγ聯(lián)合替莫唑胺治療惡性腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果。方法:通過MTT實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞增殖活性,平板克隆實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞克隆形成能力,腫瘤細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)檢測腫瘤侵襲性,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期和凋亡。結(jié)果:與對(duì)照組相比,SIFγ組細(xì)胞活性明顯降低,克隆形成能力明顯減弱,其跨膜侵襲細(xì)胞數(shù)目明顯減少,細(xì)胞周期各期無明顯改變,細(xì)胞凋亡明顯增多,并且與替莫唑胺聯(lián)合培養(yǎng)的SIFγ組對(duì)替莫唑胺的敏感性明顯增強(qiáng)。結(jié)論:與對(duì)照組和IFNγ組相比較,胎盤生長因子源性的正電荷多肽能夠增強(qiáng)野生型γ-干擾素抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的生物活性作用,并且能夠增強(qiáng)與替莫唑胺聯(lián)合使用產(chǎn)生的協(xié)同作用,進(jìn)而可以減少替莫唑胺的使用劑量以達(dá)到殺死腫瘤細(xì)胞的作用,從而減輕其副作用。第三部分SIFγ對(duì)γ-干擾素下游信號(hào)通路的影響目的:研究SIFγ與野生型IFNγ相比較,對(duì)于激活下游JAK/STAT信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路能力的影響。方法:使用雙熒光素酶檢測試劑盒檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)IFNγ下游信號(hào)通路GAS位點(diǎn)的激活狀態(tài),通過RT-PCR方法檢測各實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞內(nèi)IFNγ調(diào)節(jié)基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1的表達(dá)狀況,采用Western Blotting方法在蛋白水平檢測IFNγ調(diào)節(jié)基因蛋白的表達(dá)情況。結(jié)果:與對(duì)照組相比,SIFγ組細(xì)胞內(nèi)IFNγ調(diào)節(jié)基因CLDN7、ISG15、SERPINB1和STAT1在基因水平和蛋白水平上表達(dá)均明顯增加,并且下游JAK/STAT信號(hào)通路激活狀態(tài)明顯增強(qiáng)。結(jié)論:新合成的SIFγ融合蛋白激活I(lǐng)FNγ下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路即JAS/STAT信號(hào)通路的能力明顯增強(qiáng)。SIFγ激活JAK/STAT信號(hào)通路的機(jī)制應(yīng)該與野生型γ-干擾素相同。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1503058