本文關(guān)鍵詞： CDK9抑制劑 下咽鱗狀細(xì)胞癌 凋亡 髓細(xì)胞白血病-1蛋白 化療增敏　出處：《山東大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景和目的下咽鱗狀細(xì)胞癌(Hypopharyngeal Squamous Cell Carcinoma,HSCC)是頭頸部鱗狀細(xì)胞癌(Head and Neck Squamous Cell Carcinoma,HNSCC)中惡性程度較高的一種。該腫瘤具有早期診斷困難、分化差、易發(fā)生粘膜下擴(kuò)散及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等特點(diǎn),因此,患者預(yù)后極差,5年生存率僅為20-40%。手術(shù)聯(lián)合放、化療是目前該疾病的主要治療手段。雖然以順鉑為基礎(chǔ)藥物的化療方案在保留患者喉功能以及延長(zhǎng)患者生存時(shí)間等方面具有一定的作用,但是敏感性差且易產(chǎn)生耐藥性仍然是該腫瘤化療的一大瓶頸。因此,尋找改善下咽鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性的藥物或方法,可能是提高該疾病治療水平的一種途徑。髓細(xì)胞白血病-1(Myeloid cell leukemia-1,Mcl-1)蛋白是B細(xì)胞淋巴瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)蛋白家族中重要的抗凋亡成員之一。Mcl-1在頭頸部鱗狀細(xì)胞癌中的高表達(dá)狀態(tài),與腫瘤細(xì)胞的生存維持以及放、化療抵抗性等密切相關(guān)。研究表明,某些藥物或其他因素誘導(dǎo)頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制與Mcl-1的表達(dá)下調(diào)或功能受抑制密切相關(guān)。而且,通過(guò)反義RNA技術(shù)等降低Mcl-1的表達(dá),可以提高頭頸部鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)順鉑、5-FU等藥物的敏感性。上述研究提示我們,可以將靶向Mcl-1的藥物或方法引入到下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療中。近年來(lái),學(xué)者們創(chuàng)新性提出,可以通過(guò)尋找抑制Mcl-1轉(zhuǎn)錄的方法來(lái)降低其表達(dá)。RNA聚合酶Ⅱ(RNApolymeraselⅡ,RNAPⅡ)在Mcl-1等基因轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)及延伸的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。而RNP Ⅱ的活化需要受到上游多個(gè)分子的調(diào)控,其中正向轉(zhuǎn)錄延伸因子 b(The positive transcriptional elongation factor b,p-TEFb)磷酸化RNPⅡ羧基末端結(jié)構(gòu)域內(nèi)七肽重復(fù)序列中的第二位絲氨酸(phospho-RNAP Ⅱser2,p-RNAP Ⅱs2)是十分關(guān)鍵的一步。通過(guò) p-RNAP Ⅱs2,RNAPⅡ能夠有效地促進(jìn)RNA延伸。在p-TEFb的組成成分中,細(xì)胞周期依賴性激酶9/周期蛋白 T(cyclin-dependent kinase 9/cyclin T,CDK9/cyclin T)是磷酸化 RNAPⅡ的核心亞基。因此,學(xué)者們提出,可以通過(guò)抑制CDK9來(lái)降低Mcl-1等基因的轉(zhuǎn)錄及表達(dá)。近十幾年以來(lái),學(xué)者們已研發(fā)出多種CDK9抑制劑,其中南澳大學(xué)Shudong Wang教授團(tuán)隊(duì)合成的CDKI-73是目前活性最強(qiáng)的CDK9抑制劑之一(抑制常數(shù)Ki=3nM)。與其他CDK9抑制劑相比,CDKI-73具有對(duì)正常細(xì)胞毒性小、靶向性強(qiáng)等優(yōu)勢(shì)。在對(duì)慢性淋巴細(xì)胞白血病、急性髓系細(xì)胞白血病及卵巢癌治療作用的評(píng)價(jià)中,CDKI-73顯示了良好的殺傷腫瘤細(xì)胞的能力,但對(duì)正常細(xì)胞的毒性很小。目前,該化合物正處于申報(bào)澳大利亞及國(guó)內(nèi)一期臨床試驗(yàn)階段,具有良好的應(yīng)用前景。在本研究中,我們發(fā)現(xiàn)下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Mcl-1呈轉(zhuǎn)錄活躍的狀態(tài),且其mRNA表達(dá)水平與腫瘤的大小相關(guān),這提示我們,與頭頸部鱗狀細(xì)胞癌一致,Mcl-1可能也是維持下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生存并導(dǎo)致其對(duì)順鉑不敏感的一個(gè)因素。據(jù)此,我們推測(cè),CDK9抑制劑在抑制下咽鱗狀細(xì)胞癌的細(xì)胞生長(zhǎng)及增強(qiáng)其化療敏感性方面可能具有一定的作用。而目前尚無(wú)關(guān)于CDK9抑制劑在下咽鱗狀細(xì)胞癌中治療作用的報(bào)道。因此,我們繼續(xù)通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)評(píng)估了 CDKI-73對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)及化療敏感性的影響,并對(duì)相關(guān)機(jī)制進(jìn)行了初步的探索,以期為下咽鱗狀細(xì)胞癌的臨床治療提供新的候選藥物。研究目的1.通過(guò)對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌中Mcl-1轉(zhuǎn)錄水平的檢測(cè),明確CDKI-73在下咽鱗狀細(xì)胞癌治療中潛在的應(yīng)用價(jià)值;2.研究CDKI-73對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞生長(zhǎng)的影響及其相關(guān)機(jī)制;3.探索CDKI-73能否增強(qiáng)下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。研究方法和結(jié)果1.與癌旁正常粘膜組織相比,下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Mcl-1在mRNA水平上呈高表達(dá)狀態(tài)為檢測(cè)Mcl-1在下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中的轉(zhuǎn)錄情況,我們收集了 57例下咽鱗狀細(xì)胞癌患者的腫瘤組織標(biāo)本及31例癌旁正常粘膜組織標(biāo)本。運(yùn)用Real-time PCR技術(shù),對(duì)上述組織標(biāo)本中Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果顯示,與癌旁正常粘膜組織相比,起源于·梨狀窩(36例)、喉咽后壁(13例)及環(huán)后區(qū)(8例)的下咽鱗狀細(xì)胞癌組織中Mcl-1在mRNA水平上均表達(dá)上調(diào)(p0.01)。由此可知,Mcl-1基因在下咽鱗狀細(xì)胞癌中轉(zhuǎn)錄活躍。我們進(jìn)一步分析了腫瘤組織中Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平與患者臨床特征之間的關(guān)系,發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平與腫瘤大小(p = 0.01)及患者的臨床分期(p = 0.017)密切相關(guān)。在體積較大(最大徑超過(guò)2cm)或臨床分期(Ⅲ-Ⅳ期)較晚的患者的腫瘤組織中,Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平顯著上調(diào),提示在下咽鱗狀細(xì)胞癌中,Mcl-1可能具有維持腫瘤細(xì)胞生存的作用。2.CDKI-73具有抑制FaDu細(xì)胞增殖的作用研究顯示,CDK9抑制劑對(duì)Mcl-1高表達(dá)的腫瘤具有良好的抗增殖作用。因此,我們進(jìn)一步探索了 CDKI-73對(duì)人下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞系——FaDu細(xì)胞的體外藥理作用。在正常培養(yǎng)條件下,用不同濃度的CDKI-73分別處理FaDu細(xì)胞和HEK293細(xì)胞(即人胚腎細(xì)胞)。24小時(shí)及48小時(shí)后,利用CCK8(Cell Counting Kit-8,CCK8)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞存活率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著藥物濃度增加或者藥物作用時(shí)間延長(zhǎng),FaDu細(xì)胞的細(xì)胞存活率逐漸下降。而在相同的條件下,HEK293細(xì)胞存活率的下降程度均明顯低于FaDu細(xì)胞(p0.05或p0.01)。CDKI-73作用24小時(shí)及48小時(shí),FaDu細(xì)胞及HEK293細(xì)胞的IC50分別為5.77± 2.87μM vs.66.96 ± 25.66 μM(24 小時(shí),p= 0.01)、0.86 ±0.33 μM vs.8.82 ±4.64 μM(48小時(shí),p0.01)。由此可見(jiàn),CDKI-73對(duì)FaDu細(xì)胞的增殖具有顯著的抑制作用,且與正常細(xì)胞相比,CDKI-73對(duì)FaDu細(xì)胞的抑制作用更強(qiáng)。3.CDKI-73通過(guò)誘導(dǎo)凋亡及阻滯細(xì)胞周期來(lái)抑制FaDu細(xì)胞的增殖接下來(lái),我們首先觀察了 CDKI-73是否通過(guò)誘導(dǎo)凋亡來(lái)抑制FaDu細(xì)胞的增殖。Caspase-3活性檢測(cè)實(shí)驗(yàn)顯示,caspase-3的活化程度隨CDKI-73濃度的遞增而顯著升高。而且,作為caspase-3的剪切對(duì)象,多腺苷二磷酸多聚酶(poly(ADP-ribose)polymerase,PARP)被剪切程度也隨CDKI-73濃度的升高而增強(qiáng)。同時(shí),我們通過(guò)Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn),發(fā)現(xiàn)升高CDKI-73的濃度或者延長(zhǎng)CDKI-73的作用時(shí)間,均可引起FaDu細(xì)胞凋亡比率的增加,且在相同的處理?xiàng)l件下,FaDu細(xì)胞凋亡比率與CCK8實(shí)驗(yàn)結(jié)果相近。以上結(jié)果均提示,CDKI-73主要通過(guò)誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡來(lái)抑制其增殖。同樣地,在人咽癌胸水轉(zhuǎn)移細(xì)胞系——Detroit 562細(xì)胞系中,CDKI-73也呈劑量依賴性地激活caspase-3,并且呈時(shí)間-劑量依賴性地增加凋亡細(xì)胞比率,進(jìn)一步證實(shí)了 CDKI-73對(duì)咽部惡性腫瘤細(xì)胞的促凋亡作用。其次,我們探索了 CDKI-73是否可以阻礙FaDu細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)而影響其增殖。利用細(xì)胞周期檢測(cè)實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn),與0μM相比,低濃度(0.25 μM)的CDKI-73可以顯著地提高G0/G1期細(xì)胞比率(65.18±3.12%vs 46.13±2.22%,p0.01),而降低 S 期細(xì)胞比率(25.29±3.16%vs.46.11 ±2.54%,p0.01)。因此,我們認(rèn)為CDK丨-73還可以通過(guò)阻滯FaDu細(xì)胞周期進(jìn)程來(lái)抑制其增殖。4.CDKI-73 在 FaDu 細(xì)胞中的作用模式(Mode of action,MoA)進(jìn)一步,我們對(duì)CDKI-73在FaDu細(xì)胞中的作用機(jī)制進(jìn)行了探索。我們用不同濃度的CDKI-73處理FaDu細(xì)胞。24小時(shí)后,通過(guò)Western blot的方法對(duì)CDK9及其下游分子的磷酸化、表達(dá)情況進(jìn)行了檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著CDKI-73濃度的增加,CDK9磷酸化受到明顯的抑制,相應(yīng)地,其下游的RNAP Ⅱ的磷酸——p-RNAP Ⅱs2也被顯著減弱。而p-RNAP Ⅱs2是CDK9的生物活性標(biāo)志物,因此上述結(jié)果提示CDKI-73能夠抑制CDK9的功能。另外,上述處理也顯著降低了 FaDu細(xì)胞中Mcl-1蛋白的表達(dá)水平。進(jìn)一步,我們觀察了 CDKI-73是否通過(guò)影響Mcl-1的轉(zhuǎn)錄而降低Mcl-1的表達(dá)。用不同濃度的CDKI-73處理FaDu細(xì)胞12小時(shí),Real-time PCR實(shí)驗(yàn)顯示,RNAP Ⅱ下游的三個(gè)基因——Mcl-1、Bcl-2及 X 連鎖凋亡抑制蛋白(X-linked inhibitor of apoptosis protein,XIAP)的 mRNA 表達(dá)水平呈劑量依賴性地降低,其中Mcl-1 mRNA降低程度最為顯著,其次為Bcl-2 mRNA。上述發(fā)現(xiàn),在Detroit 562細(xì)胞中也得到了驗(yàn)證。由此可見(jiàn),CDKI-73可以通過(guò)抑制CDK9、RNAP Ⅱ,進(jìn)而降低下游Mcl-1等基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。為明確Mcl-1對(duì)CDKI-73的抑制作用更加敏感,我們給予FaDu細(xì)胞低劑量(0.5 μM)的CDKI-73,并在給藥后不同的時(shí)間點(diǎn)比較了 Mcl-1和Bcl-2兩個(gè)基因的轉(zhuǎn)錄情況,發(fā)現(xiàn)Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平較Bcl-2降低地更加迅速(p0.01)。由此可知,在下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞中,Mcl-1對(duì)CDKI-73的抑制作用更加敏感。5.CDKI-73的作用模式可能是其誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的機(jī)制為明確CDK9是否為CDKI-73誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的靶點(diǎn),我們將CDK9的小干擾RNA(分別標(biāo)記為S1和S2)及無(wú)關(guān)序列對(duì)照(scrambled nucleotide,SN)分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入FaDu細(xì)胞,以觀察干擾CDK9的表達(dá)對(duì)FaDu細(xì)胞的影響。Western blot及Real-time PCR結(jié)果顯示,干擾CDK9的表達(dá)能夠抑制RNAP Ⅱ丨的磷酸化、Mcl-1的轉(zhuǎn)錄及表達(dá),進(jìn)一步證實(shí)了 CDKI-73是通過(guò)抑制CDK9來(lái)降低Mcl-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。更重要的是,Annexin V-FITC/PI雙染法凋亡檢測(cè)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,干擾CDK9的表達(dá)可以引起FaDu細(xì)胞凋亡比率的增加(S1 v.SN,19.69±4.09%vs.9.49±2.53%,p0.05;S2 vs.SN,22.25 ±3.41%vs.9.49±2.53%,p0.05),說(shuō)明了 CDK9很可能是CDKI-73發(fā)揮促凋亡作用的靶點(diǎn)。另有研究證實(shí),降低Mcl-1的表達(dá)或抑制其功能均可以誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡。因此,通過(guò)抑制CDK9,進(jìn)而降低Mcl-1的表達(dá),很可能是CDKI-73誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的機(jī)制。6.CDKI-73能夠增強(qiáng)FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性Mcl-1的高表達(dá)是影響頭頸部鱗狀細(xì)胞癌化療敏感性的重要因素。而CDKI-73能夠有效降低FaDu細(xì)胞中Mcl-1轉(zhuǎn)錄及表達(dá),因此,我們進(jìn)一步探索了 CDKI-73能否增強(qiáng)FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。聯(lián)合指數(shù)(Combination Index,CI)是評(píng)價(jià)兩種藥物聯(lián)用時(shí)藥物之間相互作用關(guān)系的重要方法。CI1,表示兩藥具有拮抗作用;CI1,表示兩藥具有協(xié)同作用;而CI=1,表示兩藥僅有相加作用。據(jù)此,我們通過(guò)計(jì)算CI以評(píng)價(jià)CDKI-73與順鉑的關(guān)系。我們選取了一個(gè)能夠顯著降低FaDu細(xì)胞中Mcl-1表達(dá)但不會(huì)引起過(guò)多細(xì)胞凋亡的濃度,即0.25 μM。用不同濃度的順鉑單獨(dú)或者與0.25 μM CDKI-73聯(lián)合處理FaDu細(xì)胞。48小時(shí)后,利用CCK8實(shí)驗(yàn),我們獲得了 CDKI-73、順鉑單用及兩藥聯(lián)合情況下的細(xì)胞增殖抑制率,并將數(shù)據(jù)輸入專門用于計(jì)算CI的軟件——CompuSyn program。計(jì)算結(jié)果顯示,0.25 μM CDKI-73與不同濃度順鉑聯(lián)用的CI均小于1,提示CDKI-73和順鉑在抗FaDu細(xì)胞增殖方面具有協(xié)同作用,也說(shuō)明CDKI-73在改善FaDu細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性方面具有一定作用。另外,我們用Annexin V-FITC/PI雙染法,對(duì)0.25 μM CDKI-73、1 μM順鉑單用或兩藥聯(lián)用情況下的細(xì)胞凋亡比率進(jìn)行了檢測(cè)和比較。結(jié)果顯示,CDKI-73與順鉑聯(lián)合運(yùn)用對(duì)FaDu細(xì)胞的誘導(dǎo)凋亡作用(54.4 ± 8.3%)顯著強(qiáng)于CDKI-73(20.6 ± 3.0%,p0.01)及順鉑(24.7± 5.9%,p0.01)單藥運(yùn)用,進(jìn)一步驗(yàn)證了兩種藥物的協(xié)同作用。研究結(jié)論1.Mcl-1在下咽鱗狀細(xì)胞癌中存在轉(zhuǎn)錄活躍的現(xiàn)象,而且腫瘤組織中Mcl-1 mRNA的表達(dá)水平與患者的腫瘤大小及臨床分期密切相關(guān)。該現(xiàn)象提示,Mcl-1可能在下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的生存維持及化療不敏感性等方面中具有一定作用,且CDK9抑制劑可能對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌的治療具有一定的應(yīng)用價(jià)值。2.CDKI-73具有選擇性抑制FaDu細(xì)胞增殖的功能,且主要通過(guò)誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞凋亡的途徑。其次,阻滯細(xì)胞周期也有助于CDKI-73抑制FaDu細(xì)胞的增殖。由此可見(jiàn),CDKI-73單藥可能對(duì)下咽鱗狀細(xì)胞癌具有治療作用。3.通過(guò)抑制CDK9,進(jìn)而降低Mcl-1的轉(zhuǎn)錄和表達(dá),很可能是CDKI-73誘導(dǎo)FaDu細(xì)胞發(fā)生凋亡的機(jī)制。4.體外實(shí)驗(yàn)證實(shí),在抑制FaDu細(xì)胞增殖方面,CDKI-73和順鉑具有協(xié)同作用,提示CDKI-73能夠增加下咽鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞對(duì)順鉑的敏感性。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.63

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本文編號(hào)：1499728