本文關(guān)鍵詞： 食管鱗癌 轉(zhuǎn)酮醇酶樣基因1 戊糖磷酸途徑 細(xì)胞增殖 細(xì)胞周期 凋亡 侵襲　出處：《鄭州大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：食管癌(esophageal cancer,EC)占全球腫瘤相關(guān)死亡的第六位,具有廣泛的地域分布性,其最高的發(fā)病率分布在中國的北部和中部地區(qū),特別是河南和山西。目前,食管癌包括兩種主要的組織學(xué)類型,即食管鱗癌(esophageal squamous cell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EA)。多于90%的食管鱗癌分布在東亞國家。盡管在食管癌的診斷和治療上有很大的進(jìn)展,但食管癌患者5-年生存率僅為15%至25%。最為顯著的是,50%至60%的食管癌患者在診斷時即為晚期或具有轉(zhuǎn)移。因此,尋找新的食管癌的分子靶點(diǎn)和開發(fā)新的治療策略對于改善食管癌病人的預(yù)后具有十分重要的價值。重塑代謝途徑是腫瘤細(xì)胞生理變化最為顯著的特征之一,其中戊糖磷酸途徑(pentose phosphate pathway,PPP)在脂質(zhì)生成和核酸的合成中發(fā)揮重要的作用,并與多種不同腫瘤的發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān)。轉(zhuǎn)酮醇酶樣基因1(transketolase-like 1,TKTL1)是一種關(guān)鍵的代謝調(diào)節(jié)酶,參與非氧化的PPP途徑,提示其與許多腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切。目前,三種人類的轉(zhuǎn)酮醇酶基因包括TKT、TKTL1和TKTL2已經(jīng)在人類基因組中被證實(shí),但僅TKTL1是腫瘤中唯一上調(diào)的基因。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),TKTL1與多種不同腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和進(jìn)展密切相關(guān),包括膀胱癌、肺癌、子宮內(nèi)膜癌和子宮頸癌。這些研究充分顯示TKTL1在這些腫瘤中的重要價值,因而可能成為腫瘤潛在的分子治療靶點(diǎn)。然而,迄今為止,TKTL1與食管鱗癌的關(guān)系尚未見報道,因此本研究的目的是檢測TKTL1在食管鱗癌中的表達(dá),初步闡明其在食管鱗癌中的潛在的生物學(xué)功能,該研究旨在為食管鱗癌的分子靶向治療提供理論依據(jù)。第1章TKTL1在食管鱗癌組織中的表達(dá)及其與食管鱗癌病人預(yù)后的關(guān)系方法(1)采用免疫組織化學(xué)方法檢測139例食管鱗癌組織和對應(yīng)的正常食管上皮組織中TKTL1蛋白的表達(dá)。(2)采用Real-time qPCR和Western blot檢測隨機(jī)選取的8例食管鱗癌組織和對應(yīng)的8例正常食管上皮組織中TKTL1 mRNA和蛋白的表達(dá)。(3)采用半定量RT-PCR分析不同臨床分期食管鱗癌病人和不同轉(zhuǎn)移狀態(tài)的食管鱗癌病人中TKTL1 mRNA的相對表達(dá)水平。(4)利用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析TKTL1蛋白表達(dá)與食管鱗癌病人臨床病理學(xué)參數(shù)之間的關(guān)系。(5)利用Kaplan-Meier(KM)生存曲線分析TKTL1蛋白的表達(dá)與食管鱗癌患者預(yù)后的關(guān)系。(6)數(shù)據(jù)的處理:用(x|-) ±s表示數(shù)據(jù),將相關(guān)數(shù)據(jù)輸入到SPSS 17.0軟件中展開處理和分析。免疫組織化學(xué)的結(jié)果利用X2進(jìn)行評估,Western blot、Real-time qPCR和半定量RT-PCR的結(jié)果采用One-way ANOVA分析,TKTL1蛋白的表達(dá)和食管鱗癌病人預(yù)后之間的關(guān)系采用Kaplan Meier存活曲線分析。P0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)TKTL1在食管鱗癌組織中的陽性表達(dá)率為64.0%(89/139),顯著高于正常食管上皮組織(11.5%,16/139),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(X2=81.556,P=0.000)。(2)隨機(jī)選取的8例食管鱗癌組織中TKTL1 mRNA和蛋白的相對表達(dá)水平均顯著高于正常食管上皮組織,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)TKTL1 mRNA在I+II期(0.496±0.034)中的相對表達(dá)量顯著低于III+IV期的食管鱗癌病人(0.940±0.048),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(4)TKTL1 mRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(1.015±0.056)中的表達(dá)顯著高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組(0.557±0.033),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(5)TKTL1與食管鱗癌病人的性別和年齡無關(guān)(均P0.05),但與食管鱗癌的組織學(xué)分化、臨床分期和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(所有的P=0.000)。(6)Log-rank(Mantel-Cox)分析表明,具有陰性TKTL1的食管鱗癌病人的存活時間顯著高于陽性的食管鱗癌病人(P0.01)。第2章TKTL1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌細(xì)胞增殖、周期、凋亡和侵襲的影響及相關(guān)的分子機(jī)制方法(1)采用Western blot檢測幾株食管鱗癌細(xì)胞(Eca109、EC1和EC9706)和正常食管上皮細(xì)胞Het-1A中TKTL1蛋白的表達(dá)。(2)將TKTL1 siRNA轉(zhuǎn)染食管鱗癌EC1細(xì)胞,于48h收獲細(xì)胞,采用細(xì)胞裂解液提取總蛋白,采用Western blot檢測轉(zhuǎn)染TKTL1 siRNA后48h各個不同處理組中TKTL1蛋白的表達(dá)。(3)采用Real-time qPCR檢測不同處理組別的食管鱗癌EC1細(xì)胞中TKTL1、TKT和TKTL2 mRNA的表達(dá)。(4)采用酶聯(lián)方法檢測不同處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞的轉(zhuǎn)酮醇酶活性。(5)采用CCK-8試劑測定不同時間點(diǎn)不同處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞的增殖的情況。(6)利用流式細(xì)胞術(shù)檢測3組不同處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞周期及其所發(fā)生的變化。(7)流式細(xì)胞術(shù)檢測不同處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞凋亡(8)Boyden小室的主要作用是對接受各種處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞在侵襲方面的表現(xiàn)進(jìn)行檢測,以更加準(zhǔn)確地了解其侵襲能力的高低。(9)Caspase-3活性檢測試劑盒用來檢測不同處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞中caspase-3的活性。(10)Western blot用來檢測不同處理的食管鱗癌EC1細(xì)胞中cyclin D1、cdk4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9的表達(dá)。(11)數(shù)據(jù)的處理:用(x|-) ±s表示數(shù)據(jù),將相關(guān)數(shù)據(jù)輸入到SPSS 17.0軟件中展開分析,通過One-way ANOVA來處理數(shù)據(jù),P0.05代表具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果(1)和健康食管上皮細(xì)胞Het-1A相比的,食管鱗癌細(xì)胞里面TKTL1蛋白的表達(dá)水平明顯更高,組間對比結(jié)果具有顯著性差異(P0.05)。此外,TKTL1在EC1細(xì)胞中的表達(dá)又顯著高于另外2株食管鱗癌細(xì)胞Eca109和EC9706,組間對比結(jié)果具有顯著性差異(P0.05)。(2)和空白對照組、對照siRNA轉(zhuǎn)染組對比來看,TKTL1 siRNA組中TKTL1蛋白的表達(dá)顯著下調(diào),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)和空白對照組、對照siRNA轉(zhuǎn)染組對比來看,TKTL1 siRNA組中TKTL1mRNA的表達(dá)顯著下調(diào)(P0.05),而TKT和TKTL2 mRNA的表達(dá)無變化(P0.05)。(4)和空白對照組、對照siRNA轉(zhuǎn)染組對比來看,TKTL1 siRNA組中的轉(zhuǎn)酮醇酶的活性顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(5)和空白對照組、對照siRNA轉(zhuǎn)染組對比來看,TKTL1 siRNA轉(zhuǎn)染后的24h、48h、72h和96h,食管鱗癌EC1細(xì)胞的增殖速度呈現(xiàn)出程度不一的降低,并且組間對比具有顯著性差異(P0.05)。(6)與空白對照組(52.57±1.22%)和對照siRNA轉(zhuǎn)染組(52.97±2.49%)相比,TKTL1 siRNA組(63.83±0.96%)中G0/G1期的細(xì)胞數(shù)的比率大幅提高,組間對比具有顯著性差異(F=42.566,P=0.000)。相反,TKTL1 siRNA組(24.23±1.29%)中S期的細(xì)胞數(shù)的比率顯著低于未處理組(32.30±0.75%)和對照siRNA轉(zhuǎn)染組(31.70±0.92%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=59.145,P=0.000)。(7)與未處理組(7.39±0.68%)和對照siRNA轉(zhuǎn)染組(7.67±0.67%)相比,TKTL1 siRNA組(17.65±1.41%)中EC1細(xì)胞早期凋亡率顯著升高(F=106.897,P=0.000)。TKTL1 siRNA組(67.25±1.92%)中食管鱗癌EC1細(xì)胞的活細(xì)胞比率顯著低于未處理組(88.22±1.39%)和siRNA對照組(87.33±1.31%)(F=172.627,P=0.000)。(8)與未處理組和對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比,TKTL1 siRNA組中caspase-3的活性顯著升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(9)與未處理組(115.67±11.68)和對照siRNA轉(zhuǎn)染組(102.33±8.08)相比,TKTL1 siRNA組中EC1細(xì)胞的穿膜數(shù)(43.67±10.02)顯著下降,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=43.726,P=0.000)。(10)與未處理組和對照siRNA轉(zhuǎn)染組相比,TKTL1 siRNA組中,無論是cyclin D1、CDK4、Bcl-2,還是MMP-2、MMP-9,其表達(dá)水平都有大幅的降低,但Bax蛋白的表達(dá)水平明顯有所提高,且組間對比具有顯著性差異(全部對比P0.05)。第3章TKTL1表達(dá)下調(diào)對食管鱗癌裸鼠移植瘤生長的影響及初步機(jī)制方法(1)食管鱗癌EC1細(xì)胞(5×106)于皮下接種裸鼠,當(dāng)腫瘤體積達(dá)100mm3時,裸鼠分為三組進(jìn)行治療:PBS治療組、對照siRNA治療組和TKTL1 siRNA治療組,每周測量腫瘤體積2次,匯制腫瘤生長曲線,測量終止后測量腫瘤的重量。(2)Western blot用來檢測不同治療組中TKTL1、cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白的水平。(3)免疫組織化學(xué)用來檢測不同治療組中Ki-67蛋白的表達(dá),通過隨機(jī)選取40個視野中Ki-67的陽性細(xì)胞數(shù)判定不同治療組中增殖指數(shù)的變化。(4)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:數(shù)據(jù)以(x|-) ±s表示,采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)采用One-way ANOVA進(jìn)行處理,P0.05表示具有顯著性差異。結(jié)果(1)與PBS治療組和對照siRNA治療組相比,TKTL1 siRNA治療組中腫瘤的生長顯著受到抑制,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)TKTL1 siRNA治療組中腫瘤的重量(0.801±0.231)顯著低于PBS治療組(2.316±0.264)和對照siRNA治療組(2.201±0.209),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=63.915,P=0.000)。(3)TKTL1 siRNA治療組中Ki-67的增殖指數(shù)為33.35±2.14%,顯著低于PBS治療組(76.44±5.62%)和對照siRNA治療組(74.46±3.76%),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=105.729,P=0.000)。(4)與PBS治療組和對照siRNA治療組相比,TKTL1 siRNA治療組中TKTL1、cyclin D1、CDK4、Bcl-2、MMP-2和MMP-9的表達(dá)顯著下調(diào),而Bax蛋白的表達(dá)顯著上調(diào),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論(1)TKTL1在食管鱗癌中的高表達(dá)可能與食管鱗癌的發(fā)生、發(fā)展、進(jìn)展和預(yù)后關(guān)系密切。(2)TKTL1表達(dá)下調(diào)降低轉(zhuǎn)酮醇酶活性可能對食管鱗癌中PPP途徑的功能產(chǎn)生最要的影響。(3)TKTL1表達(dá)下調(diào)體外抑制食管鱗癌細(xì)胞增殖、改變細(xì)胞周期分布、誘導(dǎo)凋亡和降低侵襲能力可能與cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)的變化密切相關(guān)。(4)TKTL1 siRNA治療顯著抑制食管鱗癌裸鼠移植瘤的增殖可能與TKTL1、cyclin D1、CDK4、Bcl-2、Bax、MMP-2和MMP-9表達(dá)的表達(dá)密切相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.1

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本文編號：1485959