本文關(guān)鍵詞： PTEN 同源重組 非同源末端連接 Ku70 雙鏈斷裂修復(fù)　出處：《大連醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景:PTEN(phosphatase and tensin homologue,磷酸酶與張力蛋白同源物)作為一個(gè)抑癌蛋白,過(guò)去最為人們所熟知的是其磷酸酶活性。憑借這一性質(zhì),PTEN在細(xì)胞質(zhì)中能夠拮抗PI3K(phosphoinositide 3-kinase,磷脂酰肌醇-3-激酶)-PKB(protein kinase B,蛋白激酶B)通路,起到抑制細(xì)胞生長(zhǎng)增殖及存活的作用。除了阻遏PI3K通路之外,具有磷酸酶活性的PTEN蛋白在線粒體氧化磷酸化等多種生理過(guò)程中也發(fā)揮著重要作用。隨著PTEN研究的深入,該蛋白在細(xì)胞核內(nèi)維持基因組穩(wěn)定性方面的作用受到廣泛關(guān)注。基因組穩(wěn)定性與DNA結(jié)構(gòu)的完整性密切相關(guān),活性氧及電離輻射等因素攻擊細(xì)胞DNA時(shí),常常使細(xì)胞DNA鏈?zhǔn)艿綋p傷,其中雙鏈斷裂損傷是危害性最大的一類。DNA雙鏈斷裂損傷修復(fù)的途徑主要有兩條,分別為同源重組修復(fù)方式和非同源末端連接通路。同源重組修復(fù)發(fā)生在S期或G2期,以未受損的姐妹染色單體DNA為模板,在多種蛋白的作用下進(jìn)行精確修復(fù)。而非同源末端連接并不需要同源鏈做為模板,因此,修復(fù)后往往存在DNA序列的改變,這類修復(fù)方式并不保真。目前,雖然認(rèn)為PTEN在雙鏈斷裂修復(fù)中發(fā)揮重要作用,但在這兩種修復(fù)通路中的具體作用機(jī)制仍不清楚。目的:本研究主要探索了PTEN在同源重組修復(fù)途徑和非同源末端連接通路中所起的作用以及分子機(jī)制。癌癥的發(fā)生往往伴隨著PTEN功能的缺失,因此,對(duì)于該蛋白在DNA雙鏈斷裂修復(fù)方式中作用的研究能夠揭示PTEN缺失型癌癥獨(dú)特的DNA修復(fù)方式,從而為癌癥病人的臨床診療方案提供更多的理論支持及新思路。方法:重疊延伸PCR法用于構(gòu)建不同PTEN的突變體。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)不同細(xì)胞發(fā)生DNA雙鏈斷裂損傷后的修復(fù)能力。免疫熒光實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)磷酸化H2AX灶點(diǎn)數(shù)量。Western blot用于檢測(cè)各細(xì)胞系中PTEN蛋白及非同源末端連接、同源重組修復(fù)通路中相關(guān)蛋白的表達(dá)�；趐UC19質(zhì)粒的不相容末端連接法以及非同源末端連接質(zhì)粒報(bào)告系統(tǒng)法用于檢測(cè)細(xì)胞的非同源末端連接效率。電泳遷移率實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)Ku70復(fù)合物與生物素標(biāo)記探針模擬的DNA雙鏈斷裂處的結(jié)合能力。染色質(zhì)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Ku70蛋白與DNA雙鏈斷裂損傷處的結(jié)合能力。MTT實(shí)驗(yàn)用于檢測(cè)攜帶不同PTEN突變體的細(xì)胞對(duì)各類DNA損傷藥物的敏感性。結(jié)果:在缺失內(nèi)源性PTEN的人乳腺癌細(xì)胞系BT549中,我們分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染了野生型PTEN、磷酸酶活性位點(diǎn)突變PTEN以及小泛素化位點(diǎn)突變PTEN。單細(xì)胞凝膠電泳實(shí)驗(yàn)以及磷酸化H2AX的檢測(cè)證明PTEN促進(jìn)了細(xì)胞DNA雙鏈斷裂修復(fù)的進(jìn)程,且它的這一功能在PTEN磷酸酶活性受損后并不降低,而該作用在PTEN小泛素化位點(diǎn)突變不能入核后降低。Western blot檢測(cè)攜帶不同PTEN突變體的細(xì)胞遭受輻射處理后Rad51表達(dá)情況,結(jié)果證明細(xì)胞核內(nèi)存在PTEN時(shí),細(xì)胞的同源重組修復(fù)效率較高�；趐UC19質(zhì)粒的不相容末端連接法以及非同源末端連接質(zhì)粒報(bào)告系統(tǒng)法證實(shí)核內(nèi)PTEN阻遏了非同源末端連接通路的修復(fù)效率。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),雖然非同源末端連接途徑的關(guān)鍵蛋白Ku70在各細(xì)胞系中表達(dá)量沒(méi)有顯著差異,但電泳遷移率實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明核內(nèi)PTEN存在的情況下,結(jié)合到生物素標(biāo)記的探針上的Ku70復(fù)合體相較于核內(nèi)PTEN缺失的實(shí)驗(yàn)組減少了兩到三倍。染色質(zhì)免疫共沉淀的結(jié)果也證實(shí)了核內(nèi)PTEN阻遏了Ku70與DNA的結(jié)合。在另一種存在內(nèi)源性PTEN的乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231細(xì)胞中干擾PTEN后進(jìn)行電泳遷移率實(shí)驗(yàn)證實(shí)PTEN缺失后Ku70與探針結(jié)合能力顯著提高。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)核內(nèi)PTEN缺失導(dǎo)致細(xì)胞對(duì)各類DNA損傷藥物更為敏感。結(jié)論:我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí),在細(xì)胞遭受DNA雙鏈斷裂損傷時(shí),核內(nèi)PTEN通過(guò)阻遏Ku70與DNA斷裂處的結(jié)合而下調(diào)保真性較差的非同源末端連接修復(fù)途徑,同時(shí)通過(guò)上調(diào)同源重組修復(fù)通路中的關(guān)鍵因子Rad51蛋白的表達(dá)而促進(jìn)同源重組修復(fù)途徑,從而維持了DNA的穩(wěn)定性。并且,PTEN的這一作用依賴于其在細(xì)胞核內(nèi)的定位,而與磷酸酶活性無(wú)關(guān)。
[Abstract]:Background: PTEN (phosphatase and tensin homologue, phosphatase and tensin homolog) as a tumor suppressor protein, the past is best known for its phosphatase activity. By virtue of this property, PTEN can antagonize PI3K in the cytoplasm (phosphoinositide 3-kinase, phosphatidylinositol -3- kinase -PKB (protein) kinase B protein. B kinase) pathway, inhibit cell growth and survival proliferation. In addition to blocking PI3K pathway with phosphatase activity of PTEN protein also plays an important role in various physiological processes such as mitochondrial oxidative phosphorylation. With the deep research of PTEN, the protein in maintaining genomic stability in the nuclei of the role of attention the integrity of the genome. The stability and the structure of DNA is closely related to the DNA attack of active oxygen and cell factors such as radiation, often make the DNA chains of cells are damaged, which Double strand breaks are the two main ways of the biggest harm of a kind of.DNA double strand break repair, homologous recombination repair respectively and non homologous end joining pathway. Homologous recombination repair occurs in S or G2, with intact sister chromatid DNA as template, precise repair in a variety of proteins. The non homologous end joining does not require homologous strand as a template, therefore, there are DNA sequence changes after repair, the repair is not fidelity. At present, although that PTEN play an important role in DSB repair, but the specific mechanism of action in the two repair pathway in is still not clear. Objective: This study explored the PTEN in homologous recombination repair pathway and non homologous end joining pathway plays the role and molecular mechanism. The occurrence of cancer is often accompanied by a lack of PTEN function because of this, the Study on the role of protein in the repair of DNA double strand breaks in the repair can reveal the deletion of PTEN cancer DNA unique, so as to provide new ideas and theoretical support for more clinical diagnosis and treatment of cancer patients. Methods: PCR method for overlap extension PTEN. The mutant construct different single cell gel electrophoresis for detecting different cells have ability to repair DNA double strand breaks after injury. Immunofluorescence assay was used to detect the phosphorylation of H2AX on focal point number of.Western blot for the detection of PTEN protein in various cell lines and non homologous end joining, homologous recombination repair pathway related protein expression. PUC19 plasmid incompatibility end joining method and non homologous end joining. Report system method for detecting cell non homologous end joining efficiency. Based on the electrophoretic mobility shift assay for detection of Ku70 complex and labeled probe. The binding ability of DNA double strand breaks. The chromatin immunoprecipitation for detection of intracellular Ku70 protein and DNA double strand breaks the binding capacity of.MTT experimental sensitivity for detecting PTEN mutant cells carrying different drugs for various types of DNA damage by coprecipitation experiments. Results: in human breast cancer cell line BT549 deletion of endogenous PTEN we are in stable transfection of wild-type PTEN, PTEN mutation and phosphatase activity of sumoylation site mutation PTEN. of single cell gel electrophoresis and detection of phosphorylated H2AX showed that PTEN promoted cell DNA double strand break repair process, and the function of it in the phosphatase activity of PTEN after damage is not reduced, and the role of PTEN in small ubiquitin mutant Rad51 expression after.Western cells exposed to radiation treatment reduced blot detection with a different PTEN mutants can not enter the nucleus, results show that The presence of PTEN in the nucleus of cells, homologous recombination repair efficiency is high. The repair efficiency of pUC19 plasmid incompatibility end joining method and non homologous end joining plasmid was confirmed in nuclear PTEN reporting system to prevent non homologous end joining pathway. Based on further experiments found that although the non homologous end joining pathway of Ku70 protein in the cell lines expression had no significant difference, but the electrophoretic mobility of the experimental results indicate the presence of nuclear PTEN, Ku70 complex binding to the biotinylated probe on compared to the experimental group in the nucleus PTEN deletion was reduced by two to three times. Chromatin immunoprecipitation results also confirmed that the nuclear PTEN the combination of Ku70 and repressor of DNA. The interference of PTEN in breast cancer cell lines MDA-MB-231 cells another endogenous PTEN in electrophoretic mobility after confirmed after deletion of PTEN and Ku70 probe With the ability to significantly improve the.MTT experiments confirmed that the nuclear PTEN lack of cells are more sensitive to various types of DNA damage drugs. Conclusion: Our results demonstrate that in cells exposed to DNA double strand breaks, non homologous end joining repair pathway in nuclear PTEN by combining Ku70 and DNA repression at fracture and lowered the fidelity of the poor at the same time, the expression of Rad51 protein by upregulating the homologous recombination repair pathway is the key factor in the promotion of homologous recombination repair pathway, so as to maintain the stability of DNA. Moreover, the effect of PTEN depends on its position in the nucleus, but has nothing to do with the phosphatase activity.

【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R73;Q78

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本文編號(hào)：1475327