本文關(guān)鍵詞： 腸炎相關(guān)性腸癌 CRHR1 腫瘤發(fā)生 NF-κB STAT3 CRH CRHR1 結(jié)腸癌 細(xì)胞增殖 IL-6 JAK2/STAT3 CRH CRHR1 NF-κB VEGF 血管生成　出處：《南京醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：結(jié)腸癌是我國常見的惡性腫瘤,具有高發(fā)病率和高致死率的特性。腸道炎性疾病是結(jié)腸癌發(fā)病的高危因素,例如患有潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis,UC)的病人結(jié)直腸癌的發(fā)病率顯著高于普通人群。CRHⅠ型受體(corticotropin-releasing hormone receptor 1,CRHR1)及其配體促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin-releasing hormone,CRH)和優(yōu)洛可定(Urocortin,Ucn1)已被證實對腸道炎癥具有明確的調(diào)節(jié)作用,但是它們對結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的影響尚不明了。CRH是由41個氨基酸組成的多肽,它是CRH家族肽中的一員,其他的CRH家族肽包括Ucn1、Ucn2和Ucn3。該家族肽主要是通過兩種G蛋白耦聯(lián)受體(CRHR1和CRHR2)發(fā)揮生物學(xué)功能,其中CRH主要與CRHR1結(jié)合發(fā)揮作用,它與CRHR1的結(jié)合親和力大約是與CRHR2的20倍,Ucn1與CRHR1和CRHR2均有較高親和力,而Ucn2和Ucn3則只與CRHR2結(jié)合。CRH家族成員最早被發(fā)現(xiàn)作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,調(diào)節(jié)機體對外界壓力的反應(yīng)。后期發(fā)現(xiàn)它們也廣泛分布于外周組織中并對許多疾病的炎癥反應(yīng)具有調(diào)節(jié)作用。近期研究發(fā)現(xiàn)CRH家族肽及其受體對腫瘤疾病也有調(diào)節(jié)作用,但所報道作用比較復(fù)雜。已有研究報道在潰瘍性結(jié)腸炎患者結(jié)腸中發(fā)現(xiàn)了 CRH及CRHR1的表達(dá),并且它們在腸道免疫系統(tǒng)中發(fā)揮促炎作用。此外在葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)的結(jié)腸炎小鼠模型中,研究發(fā)現(xiàn)CRHR1的敲除能明顯改善結(jié)腸炎癥狀況。以上研究表明CRH及其受體CRHR1在腸道炎癥中發(fā)揮著明顯的促炎作用。此外大量的研究證實CRH家族肽及其受體在心血管系統(tǒng)中也發(fā)揮著調(diào)節(jié)作用,能夠調(diào)節(jié)血管通透性、血管生成和血管炎癥。鑒于慢性炎癥、血管生成與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的聯(lián)系,CRH及其受體在腸道系統(tǒng)中的促炎效應(yīng)以及對血管的調(diào)節(jié)作用提示我們其潛在的促癌作用。因此,本文研究利用小鼠腸炎相關(guān)性腸癌(colitis-associated cancer,CAC)模型及結(jié)腸癌細(xì)胞系探索CRH及其受體CRHR1在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展中的作用及其可能機制。第一部分CRHR1對小鼠腸炎相關(guān)性腸癌發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用目的:明確CRHR1對小鼠CAC發(fā)生發(fā)展的調(diào)節(jié)作用。方法:利用氧化偶氮甲烷(Azoxymethane,AOM)和DSS兩種藥物誘導(dǎo)建立小鼠CAC模型。通過免疫組織化學(xué)(immunohistochemistry,IHC)、實時熒光定量PCR(quantitative RealtimePCR,qRT-PCR)和蛋白免疫印跡(Westernblot)技術(shù)檢測CAC小鼠腸道中CRHR1及其配體Ucn1和CRH的表達(dá)。選用CRHR1-/-和CRHR1+/+兩組小鼠建立CAC模型并進(jìn)行觀察對比。造模期間記錄兩組小鼠的存活率及體重變化。造模結(jié)束后觀察分析兩組小鼠結(jié)腸部位的長度、腫瘤數(shù)目和大小及腫瘤發(fā)生率。另外對結(jié)腸組織進(jìn)行組織學(xué)分析,對炎癥、潰瘍、增生、及損傷面積這四個方面進(jìn)行組織學(xué)評分。利用qRT-PCR技術(shù)檢測兩組小鼠結(jié)腸組織中炎性細(xì)胞因子的表達(dá)。最后利用末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測定法(TdT-mediated dUTP Nick-End Labeling,TUNEL)和 5-溴脫氧尿嘧啶核苷(5-bromo-2-deoxyuridine,BRDU)染色檢測兩組小鼠結(jié)腸部位細(xì)胞的凋亡和增殖水平,通過Western blot技術(shù)檢測凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)以及與腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡密切相關(guān)的兩種轉(zhuǎn)錄因子核轉(zhuǎn)錄因子κappa B(nuclear factor kappa B,NF-κB)和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子(signal transducers and activators of transcription,STAT3)的表達(dá)和磷酸化水平。結(jié)果:造模第80天分離結(jié)腸,可見腺癌發(fā)生,CAC造模成功。IHC、qRT-PCR及Western blot結(jié)果顯示CAC小鼠結(jié)腸組織中CRHR1及其配體CRH和Ucn1在mRNA和蛋白水平的表達(dá)均顯著高于正常組小鼠。此外對比CRHR1+/+和CRHR1-/-兩組造模小鼠,我們發(fā)現(xiàn)在整個造模期間CRHR1+/+小鼠存活率較低,且體重下降更為明顯。造模80天結(jié)束后,CRHR1+/+小鼠結(jié)腸部位腫瘤數(shù)目、大小及腫瘤發(fā)生率均顯著高于CRHR1-/-造模組。IHC結(jié)果顯示CRHR1+/+造模組中約有70%呈現(xiàn)高級別異型增生,且其中30%的小鼠可見腺癌發(fā)生,而僅40%的CRHR1-/-造模小鼠觀察到高級別異型增生且沒有腺癌發(fā)生。組織學(xué)評分結(jié)果顯示CRHR1+/+小鼠在炎癥、潰瘍、增生及損傷面積四個方面的評分都顯著高于CRHR1-/-小鼠。qRT-PCR結(jié)果顯示,對比CRHR1-/-造模小鼠,CRHR1+/+造模小鼠結(jié)腸組織中促炎因子白介素1β(interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(interleukin-6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumornecrosis factor-α,TNF-α)的表達(dá)顯著上升而抑炎因子白介素10(interleukin-10,IL-10)的表達(dá)顯著下降。此外TUNEL染色分析發(fā)現(xiàn)CRHR1+/+小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞凋亡活動顯著低于CRHR1-/-小鼠,而BRDU染色結(jié)果顯示CRHR1+/+小鼠結(jié)腸組織中細(xì)胞增殖活動顯著高于CRHR1-/-小鼠。同時Western blot結(jié)果顯示在CRHR1+/+小鼠結(jié)腸組織中促凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)更低而抗凋亡蛋白Bax表達(dá)更高,此外還發(fā)現(xiàn)NF-κB和STAT3的磷酸化水平也顯著高于CRHR1-/-小鼠。結(jié)論:CRHR1的存在對小鼠CAC的發(fā)生發(fā)展有明顯的促炎和促癌作用。進(jìn)一步的研究顯示CRHR1能夠增加促炎因子IL-1 β、TNF-α和IL-6的表達(dá)與分泌,此外CRHR1激活NF-κ B和STAT3信號通路并促進(jìn)結(jié)腸組織細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞的凋亡,最終促進(jìn)了 CAC的發(fā)生發(fā)展過程。第二部分CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞促增殖的影響及作用機制目的:明確CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。方法:利用IHC、qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測結(jié)腸癌病人結(jié)腸組織以及結(jié)腸癌細(xì)胞系和結(jié)腸上皮細(xì)胞系中CRH、Ucn1和CRHR1的表達(dá)。以兩種結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞DLD1和HCT116作為離體研究對象,給予CRH或CRH合并CRHR1阻斷劑Antalarmin處理,研究CRH/CRHR1信號對結(jié)腸癌細(xì)胞的影響。運用細(xì)胞增殖實驗和克隆形成實驗觀察CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的影響。并通過流式細(xì)胞術(shù)(flow cytometry,FCM)技術(shù)進(jìn)一步檢測CRH對細(xì)胞周期和凋亡的影響。利用qRT-PCR和Western blot技術(shù)檢測CRH處理對結(jié)腸癌細(xì)胞中IL-6表達(dá)的影響。利用Western blott技術(shù)分析具體的信號機制,檢測了 CRH對NF-1κB、STAT3、JAK1/2/3和SRC等蛋白的磷酸化水平的影響。對可能的關(guān)鍵信號蛋白給以相應(yīng)的抑制劑或siRNA干擾進(jìn)行研究。結(jié)果:IHC結(jié)果顯示結(jié)直腸癌病人結(jié)腸組織中CRHR1及其配體CRH和Ucn1均高表達(dá)于腺癌組織中。qRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示結(jié)腸癌細(xì)胞DLD1和HCT116中CRH和CRHR1的表達(dá)顯著高于結(jié)腸上皮細(xì)胞FHC。細(xì)胞增殖實驗和克隆形成實驗顯示CRH通過激活CRHR1能顯著促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞的增殖活性。FMC結(jié)果表明CRH能夠顯著提高G1/S期中的細(xì)胞比例從而促進(jìn)細(xì)胞增殖活動,但未見CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞有明顯的細(xì)胞凋亡影響。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)CRH能明顯誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞中IL-6的表達(dá)。此外CRH能夠促進(jìn)NF-κB、JAK2和STAT3磷酸化水平。以上CRH的作用均能被CRHR1特異型阻斷劑Antalarmin所逆轉(zhuǎn)。另外IL-6的中和抗體及小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)轉(zhuǎn)染能夠明顯抑制CRH誘導(dǎo)的STAT3和JAK2的磷酸化,說明IL-6介導(dǎo)CRH對JAK2/STAT3信號通路的激活。STAT3的抑制劑Stattic能顯著抑制CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞的促增殖作用,說明CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞增殖活動的調(diào)節(jié)依賴于STAT3。NF-κB抑制劑CAPE明顯下調(diào)CRH介導(dǎo)的IL-6表達(dá),說明CRH通過NF-1κB促進(jìn)IL-6的表達(dá)。結(jié)論:結(jié)腸癌細(xì)胞中CRH通過CRHR1促進(jìn)IL-6表達(dá)激活JAK2/STAT3信號通路從而影響細(xì)胞周期最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖。第三部分CRH對血管內(nèi)皮細(xì)胞血管生成的影響及作用機制目的:明確CRH對腫瘤血管生成的影響。方法:通過人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein vascular endothelial cells,HUVEC)在基質(zhì)膠上的小管形成實驗體外模擬血管生成。利用qRT-PCR和酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)檢測 CRH對結(jié)腸癌細(xì)胞系細(xì)胞DLD1和HCT116中血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)表達(dá)的影響。通過 NF-κB 抑制劑 CAPE 明確NF-1κB是否參與CRH對VEGF的調(diào)節(jié)。小管形成實驗檢測CRH處理后的DLD1細(xì)胞條件培養(yǎng)基對HUVEC細(xì)胞小管形成能力的影響。通過VEGF siRNA干擾VEGF的表達(dá)進(jìn)一步研究對VEGF對HUVEC細(xì)胞小管形成的影響。結(jié)果:qRT-PCR和ELISA結(jié)果顯示CRH顯著促進(jìn)DLD1細(xì)胞中VEGF的表達(dá)。且這種促進(jìn)作用被Antalarmin和CAPE抑制。小管形成實驗顯示CRH處理后的DLD1細(xì)胞上清明顯促進(jìn)HUVEC細(xì)胞的小管形成,且siRNA干擾VEGF的表達(dá)對CRH促HUVEC小管生成作用有明顯的抑制作用。結(jié)論:CRH通過CRHR1激活結(jié)腸癌細(xì)胞中NF-κB促進(jìn)VEGF的表達(dá)從而促進(jìn)血管生成。
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【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.35

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

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本文編號：1474667