本文關(guān)鍵詞： 代謝重編程 糖酵解 線粒體 OXPHOS PDK1 DCA　出處：《吉林大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：多種腫瘤細胞包括肝癌細胞表現(xiàn)出“有氧糖酵解”特性,即在有氧的條件下也依賴糖酵解產(chǎn)生ATP,同時,線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)功能降低,腫瘤細胞的這種代謝重構(gòu)現(xiàn)象稱為“Warburg effect”。近來研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細胞的藥物抵抗與糖代謝重構(gòu)相關(guān),由于不同腫瘤細胞代謝方式存在差異,有的研究推測腫瘤細胞的代謝改變可能與藥物抵抗存在關(guān)系。丙酮酸脫氫酶激酶(PDK1)作為糖代謝的關(guān)鍵酶,在多數(shù)腫瘤細胞中高表達,且PDK1高表達的腫瘤預后較差。PDK1能夠磷酸化丙酮酸脫氫酶(PDH)抑制其活性(因為PDH的抑制與“Warburg effect”相關(guān)),減少丙酮酸進入線粒體代謝,這被稱為腫瘤細胞代謝重編程的重要部分。越來越多的研究證明PDK1在腫瘤細胞糖代謝中發(fā)揮了重要作用。DCA是PDK的小分子抑制劑,能夠通過抑制PDK的活性進而活化PDH,使得代謝流由糖酵解轉(zhuǎn)向線粒體有氧氧化,進而活化線粒體途徑的凋亡。本研究組在對肝癌細胞進行實驗研究時發(fā)現(xiàn),PDK1在BEL-7402細胞中的表達明顯高于HepG2細胞,且BEL-7402細胞對DCA敏感性較差,這提示肝癌細胞對PDK1的依賴程度與腫瘤藥物抵抗間存在關(guān)系,但其具體機制尚不明確。本研究主要分析肝癌細胞HepG2和BEL-7402代謝方式差異,同時通過干擾腫瘤細胞糖代謝方式,誘導線粒體應激,增加細胞藥物敏感性,為臨床個體化治療提供思路。實驗方法:(1)MTT法檢測DCA對HepG2和BEL-7402細胞活力的影響;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白變化。(2)葡萄糖氧化法和比色法分別檢測兩株肝癌細胞外液中的葡萄糖和乳酸水平;q PCR檢測糖酵解相關(guān)酶基因表達;比色法檢測LDH酶活性;流式細胞術(shù)檢測mROS及比色法檢測檸檬酸的含量;Western Blot檢測糖酵解蛋白的表達。(3)葡萄糖、乳酸試劑盒檢測細胞葡萄糖攝取和乳酸生成的變化;實時定量PCR及Western Blot檢測DCA對糖酵解相關(guān)酶基因及蛋白的影響;試劑盒檢測LDH酶活性的變化;PCR及Western Blot檢測缺氧誘導因子HIF-1α表達的變化。(4)流式細胞術(shù)檢測m ROS及膜電勢的變化;檸檬酸試劑盒檢測線粒體內(nèi)檸檬酸的產(chǎn)量變化;Mito Tracker染色后激光共聚焦觀察線粒體形態(tài)的變化。(5)根據(jù)RNAi原理,構(gòu)建sh-PDK1質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細胞,倒置熒光顯微鏡觀察mROS的生成改變;分光光度法檢測葡萄糖消耗和乳酸生成;流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡;PCR和Western Blot檢測糖酵解相關(guān)基因和蛋白的表達。結(jié)果:(1)DCA以劑量依賴方式抑制HepG2細胞的活力并促進其凋亡;DCA 80m M時能夠明顯抑制BEL-7402細胞活力,但無明顯促凋亡作用。(2)通過檢測HepG2和BEL-7402細胞基礎(chǔ)水平的糖代謝相關(guān)指標,發(fā)現(xiàn)BEL-7402細胞糖酵解相關(guān)基因及蛋白表達較高,細胞外液中乳酸水平及LDH活性也高于HepG2細胞,同時,線粒體ROS及檸檬酸鹽含量低于HepG2細胞。(3)DCA能夠抑制HepG2和BEL-7402細胞的葡萄糖攝取及乳酸生產(chǎn),LDH活性及糖酵解相關(guān)因子HK2、LDHA、HIF-1α、GLUT1、GLUT4等蛋白和基因的表達,且對HepG2的抑制效果更為明顯。(4)DCA能夠明顯誘導HepG2細胞線粒體內(nèi)ROS和檸檬酸鹽的生成,導致膜電勢下降,BEL-7402細胞的變化則不明顯。同時,DCA能夠影響HepG2細胞線粒體的動力學,使其融合分裂平衡打破,但對BEL-7402細胞的作用并不明顯。(5)敲除PDK1,能夠明顯降低HepG2細胞的細胞活力并促進其凋亡,并且能夠抑制HepG2糖酵解相關(guān)基因及蛋白的表達,降低細胞外液葡萄糖及乳酸的生成,增加線粒體內(nèi)ROS的生成;對于BEL-7402細胞,敲除PDK1不能導致細胞凋亡,并且沒有明顯改變Bel-7402細胞的糖代謝。實驗結(jié)論:1.DCA能夠抑制HepG2細胞糖酵解,恢復其線粒體氧化磷酸化功能,并增加線粒體途徑的凋亡敏感性。2.BEL-7402細胞的糖代謝模式受DCA影響不顯著,且其對DCA敏感性較低。3.BEL-7402細胞對DCA不敏感可能與其對PDK1途徑依賴程度較低有關(guān)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

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本文編號：1472123