本文關(guān)鍵詞： 代謝重編程 糖酵解 線粒體 OXPHOS PDK1 DCA　出處：《吉林大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：多種腫瘤細(xì)胞包括肝癌細(xì)胞表現(xiàn)出“有氧糖酵解”特性,即在有氧的條件下也依賴糖酵解產(chǎn)生ATP,同時(shí),線粒體氧化磷酸化(OXPHOS)功能降低,腫瘤細(xì)胞的這種代謝重構(gòu)現(xiàn)象稱為“Warburg effect”。近來研究發(fā)現(xiàn),腫瘤細(xì)胞的藥物抵抗與糖代謝重構(gòu)相關(guān),由于不同腫瘤細(xì)胞代謝方式存在差異,有的研究推測腫瘤細(xì)胞的代謝改變可能與藥物抵抗存在關(guān)系。丙酮酸脫氫酶激酶(PDK1)作為糖代謝的關(guān)鍵酶,在多數(shù)腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),且PDK1高表達(dá)的腫瘤預(yù)后較差。PDK1能夠磷酸化丙酮酸脫氫酶(PDH)抑制其活性(因?yàn)镻DH的抑制與“Warburg effect”相關(guān)),減少丙酮酸進(jìn)入線粒體代謝,這被稱為腫瘤細(xì)胞代謝重編程的重要部分。越來越多的研究證明PDK1在腫瘤細(xì)胞糖代謝中發(fā)揮了重要作用。DCA是PDK的小分子抑制劑,能夠通過抑制PDK的活性進(jìn)而活化PDH,使得代謝流由糖酵解轉(zhuǎn)向線粒體有氧氧化,進(jìn)而活化線粒體途徑的凋亡。本研究組在對肝癌細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究時(shí)發(fā)現(xiàn),PDK1在BEL-7402細(xì)胞中的表達(dá)明顯高于HepG2細(xì)胞,且BEL-7402細(xì)胞對DCA敏感性較差,這提示肝癌細(xì)胞對PDK1的依賴程度與腫瘤藥物抵抗間存在關(guān)系,但其具體機(jī)制尚不明確。本研究主要分析肝癌細(xì)胞HepG2和BEL-7402代謝方式差異,同時(shí)通過干擾腫瘤細(xì)胞糖代謝方式,誘導(dǎo)線粒體應(yīng)激,增加細(xì)胞藥物敏感性,為臨床個(gè)體化治療提供思路。實(shí)驗(yàn)方法:(1)MTT法檢測DCA對HepG2和BEL-7402細(xì)胞活力的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;Western Blot檢測凋亡相關(guān)蛋白變化。(2)葡萄糖氧化法和比色法分別檢測兩株肝癌細(xì)胞外液中的葡萄糖和乳酸水平;q PCR檢測糖酵解相關(guān)酶基因表達(dá);比色法檢測LDH酶活性;流式細(xì)胞術(shù)檢測mROS及比色法檢測檸檬酸的含量;Western Blot檢測糖酵解蛋白的表達(dá)。(3)葡萄糖、乳酸試劑盒檢測細(xì)胞葡萄糖攝取和乳酸生成的變化;實(shí)時(shí)定量PCR及Western Blot檢測DCA對糖酵解相關(guān)酶基因及蛋白的影響;試劑盒檢測LDH酶活性的變化;PCR及Western Blot檢測缺氧誘導(dǎo)因子HIF-1α表達(dá)的變化。(4)流式細(xì)胞術(shù)檢測m ROS及膜電勢的變化;檸檬酸試劑盒檢測線粒體內(nèi)檸檬酸的產(chǎn)量變化;Mito Tracker染色后激光共聚焦觀察線粒體形態(tài)的變化。(5)根據(jù)RNAi原理,構(gòu)建sh-PDK1質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染細(xì)胞,倒置熒光顯微鏡觀察mROS的生成改變;分光光度法檢測葡萄糖消耗和乳酸生成;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡;PCR和Western Blot檢測糖酵解相關(guān)基因和蛋白的表達(dá)。結(jié)果:(1)DCA以劑量依賴方式抑制HepG2細(xì)胞的活力并促進(jìn)其凋亡;DCA 80m M時(shí)能夠明顯抑制BEL-7402細(xì)胞活力,但無明顯促凋亡作用。(2)通過檢測HepG2和BEL-7402細(xì)胞基礎(chǔ)水平的糖代謝相關(guān)指標(biāo),發(fā)現(xiàn)BEL-7402細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因及蛋白表達(dá)較高,細(xì)胞外液中乳酸水平及LDH活性也高于HepG2細(xì)胞,同時(shí),線粒體ROS及檸檬酸鹽含量低于HepG2細(xì)胞。(3)DCA能夠抑制HepG2和BEL-7402細(xì)胞的葡萄糖攝取及乳酸生產(chǎn),LDH活性及糖酵解相關(guān)因子HK2、LDHA、HIF-1α、GLUT1、GLUT4等蛋白和基因的表達(dá),且對HepG2的抑制效果更為明顯。(4)DCA能夠明顯誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞線粒體內(nèi)ROS和檸檬酸鹽的生成,導(dǎo)致膜電勢下降,BEL-7402細(xì)胞的變化則不明顯。同時(shí),DCA能夠影響HepG2細(xì)胞線粒體的動力學(xué),使其融合分裂平衡打破,但對BEL-7402細(xì)胞的作用并不明顯。(5)敲除PDK1,能夠明顯降低HepG2細(xì)胞的細(xì)胞活力并促進(jìn)其凋亡,并且能夠抑制HepG2糖酵解相關(guān)基因及蛋白的表達(dá),降低細(xì)胞外液葡萄糖及乳酸的生成,增加線粒體內(nèi)ROS的生成;對于BEL-7402細(xì)胞,敲除PDK1不能導(dǎo)致細(xì)胞凋亡,并且沒有明顯改變Bel-7402細(xì)胞的糖代謝。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:1.DCA能夠抑制HepG2細(xì)胞糖酵解,恢復(fù)其線粒體氧化磷酸化功能,并增加線粒體途徑的凋亡敏感性。2.BEL-7402細(xì)胞的糖代謝模式受DCA影響不顯著,且其對DCA敏感性較低。3.BEL-7402細(xì)胞對DCA不敏感可能與其對PDK1途徑依賴程度較低有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R735.7

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 潘宗延 ,丁鼎樂;基于調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的治癌新嘗試[J];世界科學(xué);2005年06期

2 彭岳;趙鐵建;謝海源;韋燕飛;;細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中一些細(xì)節(jié)問題的探討[J];中華中醫(yī)藥學(xué)刊;2009年06期

3 鄭麗君;夏文美;童村;;HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)與使用[J];醫(yī)藥工業(yè);1983年10期

4 李少英;李月秋;朱金玲;;三種細(xì)胞生長狀況的觀察[J];佳木斯醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào);1995年06期

5 嚴(yán)國俊;裴燕芳;朱貞宏;吳潔穎;潘金火;;實(shí)時(shí)細(xì)胞電子分析技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展[J];中國藥學(xué)雜志;2014年03期

6 陳必良,穆潤華,馬向東,王德堂,辛?xí)匝?鄭維國,嚴(yán)瑞蘭;特異性反義寡核苷酸對含HPV16的SiHa細(xì)胞的作用[J];第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2000年03期

7 孟洪弟,戚豫,潘虹,吳希如;無線粒體DNA的ρ°206細(xì)胞的培養(yǎng)及其呼吸鏈功能損害[J];中國優(yōu)生與遺傳雜志;2000年03期

8 何秉燕;鄧長生;鄒典定;劉湘芬;易有榮;;G-CSF對洛伐他汀誘導(dǎo)的K562細(xì)胞內(nèi)酸堿度及凋亡的影響[J];中華血液學(xué)雜志;2006年07期

9 黃靜紅;李德如;閻國富;;蘿卜硫素對HaCaT細(xì)胞的影響研究[J];中國美容醫(yī)學(xué);2010年11期

10 章靜波,葉祝三;保護(hù)正常組織和細(xì)胞——腫瘤化療研究中的一個(gè)動向[J];國外醫(yī)學(xué)參考資料(腫瘤學(xué)分冊);1978年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 劉令九;趙小琳;岳立廣;徐艷玲;李淑焱;侯麗娟;隋紅;姜崴;謝寶生;李勇;劉兵;李海濱;;細(xì)胞工廠培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞制備凍干甲型肝炎減毒活疫苗[A];2011中國生物制品年會暨第十一次全國生物制品學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2011年

2 宋征;;應(yīng)用Bhas42細(xì)胞試驗(yàn)檢測22個(gè)腫瘤促長基因標(biāo)志物[A];2013年（第三屆）中國藥物毒理學(xué)年會暨藥物非臨床安全性評價(jià)研究論壇論文摘要[C];2013年

3 谷彬;張輝;喻澤蘭;;依地福新對Jurkat細(xì)胞生長抑制機(jī)制的研究[A];2009醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十一屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

4 武冬梅;李秀娥;葛莉亞;袁星;;雙酚-A對MCF-7細(xì)胞伏安行為的影響[A];第五屆全國環(huán)境化學(xué)大會摘要集[C];2009年

5 李曉飛;呂超;吳小榮;韓慶玲;王杰;易宗春;;鉛和鋁離子對K562細(xì)胞紅系分化的影響[A];全國生化/工業(yè)與衛(wèi)生毒理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文集[C];2010年

6 宋為民;郭波;;復(fù)方甘草酸苷對HaCaT細(xì)胞表達(dá)AQP3的影響[A];2011全國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

7 劉魯明;錢華;陳震;林勝友;黃挺;;參麥注射液對腫瘤細(xì)胞環(huán)核甘酸的影響[A];全國中醫(yī)藥科研與教學(xué)改革研討會論文集[C];2000年

8 張雪玲;糜漫天;李等松;韋娜;張乾勇;楊志祥;;Lovastatin對HL-60細(xì)胞HMG-CoA還原酶mRNA表達(dá)及細(xì)胞增殖功能的影響[A];中國營養(yǎng)學(xué)會特殊營養(yǎng)第五屆學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2002年

9 房佰俊;廖聯(lián)明;楊少光;史明霞;趙春華;;胎兒骨髓源原始干細(xì)胞分離純化及其生物學(xué)特性的初步研究[A];第九屆全國實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會議論文摘要匯編[C];2003年

10 李曉軍;朱傳東;汪萍;賈麗;陳芳芳;夏欣一;陳龍邦;;人Id3基因在A549細(xì)胞中的表達(dá)及對細(xì)胞生長功能的研究[A];第六屆全國免疫學(xué)學(xué)術(shù)大會論文集[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 吳春燕 通訊員 寧習(xí)源 吳劍鵬;人類情緒可影響干細(xì)胞生長[N];光明日報(bào);2014年

2 馮衛(wèi)東;老化干細(xì)胞可轉(zhuǎn)變成年輕干細(xì)胞[N];科技日報(bào);2012年

3 常麗君;科學(xué)家闡明核內(nèi)周期運(yùn)作機(jī)制[N];科技日報(bào);2011年

4 本版編輯邋杜華斌 邰舉 毛文波 顧鋼 陳超 何屹 毛黎;2007年世界科技發(fā)展回顧(六)[N];科技日報(bào);2008年

5 通訊員 李靜;廈大教授發(fā)現(xiàn)細(xì)胞防癌“玄機(jī)”[N];廈門日報(bào);2009年

6 永誠;美發(fā)現(xiàn)控制細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)[N];中國醫(yī)藥報(bào);2000年

7 記者 張孟軍;加找到刺激干細(xì)胞生長分子[N];科技日報(bào);2001年

8 張?zhí)锟?干細(xì)胞研究精彩紛呈[N];中國醫(yī)藥報(bào);2011年

9 邵薇/編譯;T細(xì)胞的非凡能力[N];北京科技報(bào);2003年

10 經(jīng)天;控制細(xì)胞生長的蛋白質(zhì)[N];中藥事業(yè)報(bào);2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 蔣淵;缺氧肝癌細(xì)胞中HIF-1和NF-κB的相互作用及其分子機(jī)制的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 張廣;肝星狀細(xì)胞在肝癌細(xì)胞惡性行為中的作用及機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

3 付托;活性氧族在CHO細(xì)胞補(bǔ)料批次培養(yǎng)中的作用、機(jī)制及調(diào)控研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2016年

4 彭林;重組凝血因子VII在CHO細(xì)胞中的高效表達(dá)[D];江南大學(xué);2017年

5 楊靜波;土貝母甲素對雄激素非依賴性前列腺癌細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制研究[D];吉林大學(xué);2017年

6 李麟;USP18在IFN-α抗乙肝病毒機(jī)制中的作用及調(diào)控研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2017年

7 楊小超;陽離子配體修飾的納米金用于細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)和微囊自組裝研究[D];重慶大學(xué);2010年

8 葉玲玲;基于生物素誘導(dǎo)表達(dá)系統(tǒng)的HEK293細(xì)胞多基因代謝工程改造[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2011年

9 梁國斌;產(chǎn)朊假絲酵母生產(chǎn)谷胱甘肽過程控制與優(yōu)化[D];江南大學(xué);2008年

10 楊海虹;鈣池操縱性鈣內(nèi)流在人肺腺癌A549細(xì)胞中的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 柯自立;硫酸鎂對6-羥基多巴胺損傷的SH-SY5Y細(xì)胞的保護(hù)作用[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 李婷婷;細(xì)胞穿透肽VP22對抑癌蛋白PTEN體外抗腫瘤作用影響的研究[D];川北醫(yī)學(xué)院;2015年

3 王靜;環(huán)氧化物酶抑制劑NS-398聯(lián)合奧沙利鉑對宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 鄭祿祿;番茄紅素對轉(zhuǎn)染SOD1-G93A的PC12細(xì)胞線粒體的保護(hù)作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

5 宋晨源;氯化銨對人正常肝細(xì)胞系changliver中二氫乳清酸脫氫酶表達(dá)的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

6 張莉;白藜蘆醇體外抑制腸道病毒71型的作用機(jī)制研究[D];蘇州大學(xué);2015年

7 高華武;富硒芪云抗腫瘤作用及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

8 宋加奎;丹參對人胃癌SGC-7901細(xì)胞化療敏感性的影響[D];安徽中醫(yī)藥大學(xué);2015年

9 許雅鑫;尼古丁對NCI-H1975和NCI-H460細(xì)胞促進(jìn)增殖作用及對PI3K/Akt通路的影響研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

10 高娜;加減駐景方含藥血清對二氯化鈷誘導(dǎo)后ARPE-19細(xì)胞表達(dá)VEGF及HIF-1α的影響[D];青海大學(xué);2015年

，

本文編號：1472123