本文關(guān)鍵詞： 肝細(xì)胞癌 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 外泌體 巨噬細(xì)胞 免疫　出處：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國(guó)常見的惡性腫瘤之一,外科手術(shù)是最有效的治療方法,但超過80%的患者診斷時(shí)已失去了手術(shù)機(jī)會(huì)。全身性化療是晚期肝癌患者的主要治療方法,但不論是單藥還是多藥聯(lián)合治療效果均不理想。因此,如何提高HCC治療效果是腫瘤學(xué)界研究的熱點(diǎn)。腫瘤微環(huán)境(tumor microenviroment)通常是由腫瘤細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞、微血管、組織液及一些浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞(如樹突狀細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞等)組成,其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,由于腫瘤血管的“畸形”生長(zhǎng)以及腫瘤細(xì)胞的快速增殖必然導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞長(zhǎng)期處于缺血、缺氧和低p H的腫瘤微環(huán)境中,而這些因素均可誘導(dǎo)微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress,ERS)以應(yīng)對(duì)惡劣的生存條件,維持自身生存。4巨噬細(xì)胞是一種可塑性很強(qiáng)的細(xì)胞,在維持機(jī)體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),調(diào)控新生血管形成等方面具有重要作用。多項(xiàng)研究表明,巨噬細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分,且腫瘤微環(huán)境中的巨噬細(xì)胞在多種因素的作用下常常發(fā)生表型變化轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞(tumor-associated macrophage,TAM),進(jìn)而發(fā)揮促進(jìn)腫瘤增殖、侵襲遷移等有利于腫瘤進(jìn)展的作用。然而,腫瘤細(xì)胞通過何種途徑使原本具有抗腫瘤的巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M(jìn)腫瘤發(fā)展的巨噬細(xì)胞尚不清楚。Exosome是一類直徑大約為40-100nm的圓形或類圓形囊泡樣結(jié)構(gòu),近年研究發(fā)現(xiàn)其在細(xì)胞間信號(hào)傳遞中發(fā)揮重要作用。因此,深入研究微環(huán)境中的腫瘤細(xì)胞如何將應(yīng)激信號(hào)傳遞給與巨噬細(xì)胞,進(jìn)而改變其免疫功能具有重要的臨床意義。本課題擬探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝癌細(xì)胞能否影響巨噬細(xì)胞的免疫功能及可能的分子機(jī)制。目的通過將處于ERS狀態(tài)與未ERS的肝癌細(xì)胞釋放的exosome與巨噬細(xì)胞共培養(yǎng),觀察巨噬細(xì)胞PD-L1及炎癥因子的表達(dá)狀況,了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝癌細(xì)胞對(duì)巨噬細(xì)胞免疫功能的影響。并通過高通量測(cè)序探討ERS是否影響肝癌細(xì)胞exosomal-mi RNAs的分泌,進(jìn)一步研究肝癌細(xì)胞ERS相關(guān)exosome調(diào)控巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)的具體機(jī)制。方法(1)分別使用不同濃度的TM作用肝癌細(xì)胞24小時(shí)和同一濃度TM作用肝癌細(xì)胞不同時(shí)間,采用Western-Blot方法檢測(cè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志蛋白GRP78的變化。(2)使用3μM的TM與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí),分別收集TM處理組(Exo-TM)和未處理組細(xì)胞(Exo-con)的上清液,使用Exo Quick-TC試劑盒提取exosome,透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察exosome的形態(tài)、大小,Western-Blot方法檢測(cè)exosomes標(biāo)志蛋白CD63、TSG101以及分子伴侶蛋白Calnexin的表達(dá)。(3)使用膜染料PKH67標(biāo)記exosome,然后將PKH67標(biāo)記的exosomes與巨噬細(xì)胞共同孵育或尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi),12h后共聚焦顯微鏡觀察巨噬細(xì)胞吞噬exosome的情況。(4)將不同的exosome(Exo-con和Exo-TM)與THP-1巨噬細(xì)胞(經(jīng)100ng/ml PMA誘導(dǎo)48小時(shí)所得)共培養(yǎng)24小時(shí),分別收集細(xì)胞和上清液,使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1表達(dá),CBA細(xì)胞因子試劑盒檢測(cè)炎癥因子表達(dá)。(5)將不同exosome(Exo-con和Exo-TM)與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí),收集細(xì)胞,提取總RNA,進(jìn)行Affymetrix m RNA表達(dá)譜芯片檢測(cè),以了解PD-L1和炎癥因子等m RNA水平表達(dá)變化。(6)分別對(duì)裸鼠尾靜脈注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-TM,隔日一次,共10次。注射結(jié)束后24h,處死裸鼠收集腹腔巨噬細(xì)胞,貼壁2小時(shí)后換液棄去未貼壁細(xì)胞,剩余細(xì)胞培養(yǎng)過夜后收集細(xì)胞和上清液,流式細(xì)胞儀檢測(cè)PD-L1和炎癥因子的表達(dá)。(7)高通量測(cè)序檢測(cè)ERS和未ERS的Hep G2細(xì)胞來源的exosomes中mi RNAs的表達(dá)差異,KEGG、GO分析與巨噬細(xì)胞免疫功能相關(guān)的mi RNAs及通路變化。(8)分別收集Exo-con和Exo-TM與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后的細(xì)胞,提取總蛋白,Western-Blot方法檢測(cè)PTEN、AKT和p-AKT等蛋白水平變化。(9)使用si RNA干擾THP-1巨噬細(xì)胞PTEN表達(dá),Western-Blot方法檢測(cè)PTEN-PI3K-AKT通路蛋白變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)干擾后THP-1巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)變化。(10)使用mi RNA-23a-3p的mimics、inhibitor以及各自的對(duì)照轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細(xì)胞后,Western-Blot方法檢測(cè)PTEN、AKT和p-AKT等蛋白水平變化,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)THP-1巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)變化。結(jié)果(1)TM可濃度依賴性地上調(diào)肝癌細(xì)胞GRP78表達(dá),但當(dāng)TM濃度達(dá)到3μM時(shí),增加TM濃度僅輕微增加GRP78蛋白表達(dá);3μM濃度的TM與肝癌細(xì)胞共培養(yǎng),隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)GRP78表達(dá)增加,但24小時(shí)與48小時(shí)結(jié)果無差異(P=0.671)。(2)透射電鏡可見收集到的“exosome”呈圓形或類圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu),直徑為40-100nm,符合exosome的典型特征。Western-Blot檢測(cè)顯示所得的“exosome”表達(dá)CD63和TSG101,但不表達(dá)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白Calnexin,進(jìn)一步證明上清中收集到的是不含細(xì)胞成分的exosome。BCA蛋白定量法對(duì)所得exosome總蛋白進(jìn)行定量,結(jié)果表明TM作用24h后肝癌細(xì)胞分泌的exosomes明顯增加(P0.01)。(3)激光共聚焦顯微鏡顯示,PKH67標(biāo)記的exosomes能夠被THP-1巨噬細(xì)胞和腹腔巨噬細(xì)胞所攝取,流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果進(jìn)一步證明腹腔巨噬細(xì)胞能夠攝取PKH67標(biāo)記的exosome。(4)Affymetrix m RNA表達(dá)譜芯片檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組和Exo-con組相比Exo-TM可明顯上調(diào)PD-L1和多種炎癥因子(如IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α等)的m RNA表達(dá)水平。(5)流式細(xì)胞術(shù)和免疫組化結(jié)果均顯示,與對(duì)照組和Exo-con組相比Exo-TM可明顯上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞PD-L1。CBA炎癥因子檢測(cè)結(jié)果顯示,Exo-con和Exo-TM均可上調(diào)IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達(dá),且exo-TM的作用更明顯。類似的,將Exo-con和Exo-TM通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi),Exo-TM注射小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)也明顯上升,且細(xì)胞上清中的IL-6,IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達(dá)明顯升高。(6)對(duì)Exo-con和Exo-TM進(jìn)行mi RNAs高通量測(cè)序,結(jié)果顯示共有112個(gè)差異表達(dá)的mi RNAs,其中14個(gè)mi RNAs的表達(dá)存在顯著差異性。相對(duì)于Exo-con組,Exo-TM組中有8個(gè)mi RNAs顯著上調(diào),6個(gè)mi RNAs顯著下調(diào)。q RT-PCR驗(yàn)證結(jié)果顯示mi R-23a-3p和mi R-29a-3p在Exo-TM組分別上調(diào)了2.44倍和1.95倍,而mi R-486-3p和mi R-486-5p在Exo-TM組分別下調(diào)了0.87倍和1.96倍。經(jīng)生物信息學(xué)分析軟件預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)在PTEN可能是mi R-23a-3p的靶基因之一,它可能通過調(diào)控PI3K-AKT通路發(fā)揮作用。(7)Western-Blot檢測(cè)顯示Exo-TM與THP-1巨噬細(xì)胞共培養(yǎng)24小時(shí)后能顯著下調(diào)PTEN蛋白水平并升高p-AKT水平。轉(zhuǎn)染PTEN特異性si RNA干擾PTEN表達(dá)可明顯上調(diào)巨噬細(xì)胞PD-L1的表達(dá)。(8)轉(zhuǎn)染mi R-23a-3p mimics使THP-1巨噬細(xì)胞PTEN蛋白明顯下調(diào),p AKT蛋白水平明顯上調(diào)。與此相反,轉(zhuǎn)染mi R-23a-3p inhibitor上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞PTEN蛋白,同時(shí)下調(diào)p AKT蛋白水平。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-23a-3p mimics能夠明顯升高THP-1巨噬細(xì)胞的PD-L1表達(dá)水平。結(jié)論(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激影響肝癌細(xì)胞exosome的分泌。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝癌細(xì)胞釋放的exosome能夠被巨噬細(xì)胞吞噬攝取,并通過上調(diào)PD-L1和炎癥因子表達(dá)等方式影響其免疫功能。(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的肝癌細(xì)胞釋放的exosome通過傳遞mi RNA-23a-3p抑制PTEN表達(dá),從而激活PI3K-AKT-PD-L1通路上調(diào)巨噬細(xì)胞PD-L1表達(dá)。
[Abstract]:Objective : To study the effect of tumor cells on the immune function of tumor cells and to study the effect of tumor cells on the immune function of tumor cells . ( 2 ) The expression of exosomes , Exo - con and Exo - TM was detected by means of Exo Quick - TC kit . Western - Blot was used to detect the changes of the expression of p78 protein . The results showed that there was no difference in the expression of p78 protein . ( 1 ) The results showed that the exosomes collected in the supernatant were significantly increased ( P0.01 ) . The results showed that the exosomes collected in the supernatant were able to be absorbed by THP - 1 macrophages and macrophages . The expression of IL - 1尾 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 10 and TNF - 偽 in Exo - TM group was significantly higher than that of control group and Exo - con group . The results showed that both Exo - con and Exo - TM could regulate the expression of IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 10 and TNF - 偽 . Conclusion ( 1 ) The exosome of hepatoma cells released by endoplasmic reticulum stress can significantly increase the expression level of PTEN protein in THP - 1 macrophages . Conclusion ( 1 ) The exosome of hepatoma cells exposed to endoplasmic reticulum stress can be phagocytized by macrophages , and the expression of PTEN is inhibited by increasing the expression of PD - L1 and inflammatory factors .

【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1471963