本文關鍵詞： 肝細胞癌 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激 外泌體 巨噬細胞 免疫　出處：《安徽醫(yī)科大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景肝細胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是我國常見的惡性腫瘤之一,外科手術(shù)是最有效的治療方法,但超過80%的患者診斷時已失去了手術(shù)機會。全身性化療是晚期肝癌患者的主要治療方法,但不論是單藥還是多藥聯(lián)合治療效果均不理想。因此,如何提高HCC治療效果是腫瘤學界研究的熱點。腫瘤微環(huán)境(tumor microenviroment)通常是由腫瘤細胞、間質(zhì)細胞、微血管、組織液及一些浸潤的免疫細胞(如樹突狀細胞、巨噬細胞和T淋巴細胞等)組成,其與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系。在肝癌的發(fā)生、發(fā)展過程中,由于腫瘤血管的“畸形”生長以及腫瘤細胞的快速增殖必然導致腫瘤細胞長期處于缺血、缺氧和低p H的腫瘤微環(huán)境中,而這些因素均可誘導微環(huán)境中的腫瘤細胞發(fā)生內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激(endoplasmic reticulum stress,ERS)以應對惡劣的生存條件,維持自身生存。4巨噬細胞是一種可塑性很強的細胞,在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài),調(diào)控新生血管形成等方面具有重要作用。多項研究表明,巨噬細胞是腫瘤微環(huán)境中的重要組成部分,且腫瘤微環(huán)境中的巨噬細胞在多種因素的作用下常常發(fā)生表型變化轉(zhuǎn)變?yōu)槟[瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage,TAM),進而發(fā)揮促進腫瘤增殖、侵襲遷移等有利于腫瘤進展的作用。然而,腫瘤細胞通過何種途徑使原本具有抗腫瘤的巨噬細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榇龠M腫瘤發(fā)展的巨噬細胞尚不清楚。Exosome是一類直徑大約為40-100nm的圓形或類圓形囊泡樣結(jié)構(gòu),近年研究發(fā)現(xiàn)其在細胞間信號傳遞中發(fā)揮重要作用。因此,深入研究微環(huán)境中的腫瘤細胞如何將應激信號傳遞給與巨噬細胞,進而改變其免疫功能具有重要的臨床意義。本課題擬探討內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的肝癌細胞能否影響巨噬細胞的免疫功能及可能的分子機制。目的通過將處于ERS狀態(tài)與未ERS的肝癌細胞釋放的exosome與巨噬細胞共培養(yǎng),觀察巨噬細胞PD-L1及炎癥因子的表達狀況,了解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的肝癌細胞對巨噬細胞免疫功能的影響。并通過高通量測序探討ERS是否影響肝癌細胞exosomal-mi RNAs的分泌,進一步研究肝癌細胞ERS相關exosome調(diào)控巨噬細胞PD-L1表達的具體機制。方法(1)分別使用不同濃度的TM作用肝癌細胞24小時和同一濃度TM作用肝癌細胞不同時間,采用Western-Blot方法檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激標志蛋白GRP78的變化。(2)使用3μM的TM與肝癌細胞共培養(yǎng)24小時,分別收集TM處理組(Exo-TM)和未處理組細胞(Exo-con)的上清液,使用Exo Quick-TC試劑盒提取exosome,透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscope,TEM)觀察exosome的形態(tài)、大小,Western-Blot方法檢測exosomes標志蛋白CD63、TSG101以及分子伴侶蛋白Calnexin的表達。(3)使用膜染料PKH67標記exosome,然后將PKH67標記的exosomes與巨噬細胞共同孵育或尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi),12h后共聚焦顯微鏡觀察巨噬細胞吞噬exosome的情況。(4)將不同的exosome(Exo-con和Exo-TM)與THP-1巨噬細胞(經(jīng)100ng/ml PMA誘導48小時所得)共培養(yǎng)24小時,分別收集細胞和上清液,使用流式細胞儀檢測PD-L1表達,CBA細胞因子試劑盒檢測炎癥因子表達。(5)將不同exosome(Exo-con和Exo-TM)與THP-1巨噬細胞共培養(yǎng)24小時,收集細胞,提取總RNA,進行Affymetrix m RNA表達譜芯片檢測,以了解PD-L1和炎癥因子等m RNA水平表達變化。(6)分別對裸鼠尾靜脈注射100μl的PBS、Exo-con和Exo-TM,隔日一次,共10次。注射結(jié)束后24h,處死裸鼠收集腹腔巨噬細胞,貼壁2小時后換液棄去未貼壁細胞,剩余細胞培養(yǎng)過夜后收集細胞和上清液,流式細胞儀檢測PD-L1和炎癥因子的表達。(7)高通量測序檢測ERS和未ERS的Hep G2細胞來源的exosomes中mi RNAs的表達差異,KEGG、GO分析與巨噬細胞免疫功能相關的mi RNAs及通路變化。(8)分別收集Exo-con和Exo-TM與THP-1巨噬細胞共培養(yǎng)24小時后的細胞,提取總蛋白,Western-Blot方法檢測PTEN、AKT和p-AKT等蛋白水平變化。(9)使用si RNA干擾THP-1巨噬細胞PTEN表達,Western-Blot方法檢測PTEN-PI3K-AKT通路蛋白變化,流式細胞術(shù)檢測干擾后THP-1巨噬細胞PD-L1表達變化。(10)使用mi RNA-23a-3p的mimics、inhibitor以及各自的對照轉(zhuǎn)染THP-1巨噬細胞后,Western-Blot方法檢測PTEN、AKT和p-AKT等蛋白水平變化,流式細胞術(shù)檢測THP-1巨噬細胞PD-L1表達變化。結(jié)果(1)TM可濃度依賴性地上調(diào)肝癌細胞GRP78表達,但當TM濃度達到3μM時,增加TM濃度僅輕微增加GRP78蛋白表達;3μM濃度的TM與肝癌細胞共培養(yǎng),隨著作用時間的延長GRP78表達增加,但24小時與48小時結(jié)果無差異(P=0.671)。(2)透射電鏡可見收集到的“exosome”呈圓形或類圓形膜性囊泡樣結(jié)構(gòu),直徑為40-100nm,符合exosome的典型特征。Western-Blot檢測顯示所得的“exosome”表達CD63和TSG101,但不表達內(nèi)質(zhì)網(wǎng)分子伴侶蛋白Calnexin,進一步證明上清中收集到的是不含細胞成分的exosome。BCA蛋白定量法對所得exosome總蛋白進行定量,結(jié)果表明TM作用24h后肝癌細胞分泌的exosomes明顯增加(P0.01)。(3)激光共聚焦顯微鏡顯示,PKH67標記的exosomes能夠被THP-1巨噬細胞和腹腔巨噬細胞所攝取,流式細胞術(shù)結(jié)果進一步證明腹腔巨噬細胞能夠攝取PKH67標記的exosome。(4)Affymetrix m RNA表達譜芯片檢測結(jié)果顯示,與對照組和Exo-con組相比Exo-TM可明顯上調(diào)PD-L1和多種炎癥因子(如IL-1α,IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α等)的m RNA表達水平。(5)流式細胞術(shù)和免疫組化結(jié)果均顯示,與對照組和Exo-con組相比Exo-TM可明顯上調(diào)THP-1巨噬細胞PD-L1。CBA炎癥因子檢測結(jié)果顯示,Exo-con和Exo-TM均可上調(diào)IL-1β,IL-6,IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達,且exo-TM的作用更明顯。類似的,將Exo-con和Exo-TM通過尾靜脈注射到裸鼠體內(nèi),Exo-TM注射小鼠的腹腔巨噬細胞PD-L1表達也明顯上升,且細胞上清中的IL-6,IL-10和TNF-α等炎癥因子的表達明顯升高。(6)對Exo-con和Exo-TM進行mi RNAs高通量測序,結(jié)果顯示共有112個差異表達的mi RNAs,其中14個mi RNAs的表達存在顯著差異性。相對于Exo-con組,Exo-TM組中有8個mi RNAs顯著上調(diào),6個mi RNAs顯著下調(diào)。q RT-PCR驗證結(jié)果顯示mi R-23a-3p和mi R-29a-3p在Exo-TM組分別上調(diào)了2.44倍和1.95倍,而mi R-486-3p和mi R-486-5p在Exo-TM組分別下調(diào)了0.87倍和1.96倍。經(jīng)生物信息學分析軟件預測發(fā)現(xiàn)在PTEN可能是mi R-23a-3p的靶基因之一,它可能通過調(diào)控PI3K-AKT通路發(fā)揮作用。(7)Western-Blot檢測顯示Exo-TM與THP-1巨噬細胞共培養(yǎng)24小時后能顯著下調(diào)PTEN蛋白水平并升高p-AKT水平。轉(zhuǎn)染PTEN特異性si RNA干擾PTEN表達可明顯上調(diào)巨噬細胞PD-L1的表達。(8)轉(zhuǎn)染mi R-23a-3p mimics使THP-1巨噬細胞PTEN蛋白明顯下調(diào),p AKT蛋白水平明顯上調(diào)。與此相反,轉(zhuǎn)染mi R-23a-3p inhibitor上調(diào)THP-1巨噬細胞PTEN蛋白,同時下調(diào)p AKT蛋白水平。流式細胞術(shù)檢測結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染mi R-23a-3p mimics能夠明顯升高THP-1巨噬細胞的PD-L1表達水平。結(jié)論(1)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激影響肝癌細胞exosome的分泌。(2)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的肝癌細胞釋放的exosome能夠被巨噬細胞吞噬攝取,并通過上調(diào)PD-L1和炎癥因子表達等方式影響其免疫功能。(3)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應激的肝癌細胞釋放的exosome通過傳遞mi RNA-23a-3p抑制PTEN表達,從而激活PI3K-AKT-PD-L1通路上調(diào)巨噬細胞PD-L1表達。
[Abstract]:Objective : To study the effect of tumor cells on the immune function of tumor cells and to study the effect of tumor cells on the immune function of tumor cells . ( 2 ) The expression of exosomes , Exo - con and Exo - TM was detected by means of Exo Quick - TC kit . Western - Blot was used to detect the changes of the expression of p78 protein . The results showed that there was no difference in the expression of p78 protein . ( 1 ) The results showed that the exosomes collected in the supernatant were significantly increased ( P0.01 ) . The results showed that the exosomes collected in the supernatant were able to be absorbed by THP - 1 macrophages and macrophages . The expression of IL - 1尾 , IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 10 and TNF - 偽 in Exo - TM group was significantly higher than that of control group and Exo - con group . The results showed that both Exo - con and Exo - TM could regulate the expression of IL - 1尾 , IL - 6 , IL - 10 and TNF - 偽 . Conclusion ( 1 ) The exosome of hepatoma cells released by endoplasmic reticulum stress can significantly increase the expression level of PTEN protein in THP - 1 macrophages . Conclusion ( 1 ) The exosome of hepatoma cells exposed to endoplasmic reticulum stress can be phagocytized by macrophages , and the expression of PTEN is inhibited by increasing the expression of PD - L1 and inflammatory factors .

【學位授予單位】：安徽醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R735.7

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本文編號：1471963