本文關(guān)鍵詞： 肺腺癌 MGST1 細(xì)胞凋亡 caspase　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率在我國及全世界均高居首位。肺腺癌是肺癌最常見的組織類型之一,發(fā)現(xiàn)時(shí)常處于晚期,預(yù)后較差。近年雖在分子機(jī)制研究上取得較大進(jìn)展,但其發(fā)病機(jī)制遠(yuǎn)未闡明。因此研究肺腺癌的致病驅(qū)動(dòng)基因,探尋肺腺癌新的治療靶基因具有重大意義。研究表明,MGST1與食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關(guān),且在轉(zhuǎn)基因小鼠肺癌中高表達(dá),但其在肺癌中所發(fā)揮的功能和作用機(jī)制研究尚未見報(bào)道。我們前期研究發(fā)現(xiàn)MGST1在人肺腺癌組織標(biāo)本中高表達(dá),抑制肺腺癌細(xì)胞A549中MGST1的表達(dá)后,可抑制細(xì)胞增殖活性,促進(jìn)細(xì)胞凋亡的發(fā)生,但機(jī)制尚未闡明。因此,闡明MGST1促進(jìn)肺腺癌凋亡的作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究,MGST1有望成為肺腺癌新候選治療靶基因。研究目的:本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用慢病毒干擾肺腺癌細(xì)胞系PC-9內(nèi)源性MGST1的表達(dá)和過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1增加外源性MGST1的表達(dá),從正反兩方面初步研究MGST1在肺腺癌細(xì)胞中發(fā)揮的生物學(xué)功能,并進(jìn)行機(jī)制探討,旨在獲得MGST1在肺腺癌惡性進(jìn)程中發(fā)揮重要作用的可靠實(shí)驗(yàn)證據(jù),為MGST1成為肺腺癌新候選治療靶基因提供科學(xué)依據(jù)。研究方法:本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用Western-blot檢測肺上皮細(xì)胞系BEAS-2B及肺腺癌細(xì)胞系SPC-A-1、H2342、A549、H1975、PC-9、XLA-07 中 MGST1 蛋白的基礎(chǔ)表達(dá)水平,并選擇PC-9及SPC-A-1作為后期研究的工具細(xì)胞;運(yùn)用慢病毒感染肺腺癌PC-9細(xì)胞,干擾內(nèi)源性MGST1的表達(dá),Western-blot驗(yàn)證干擾效果、MTS檢測增殖活性、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測克隆形成能力、流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡、Western-blot檢測相關(guān)凋亡蛋白變化;運(yùn)用構(gòu)建重組質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染篩選穩(wěn)定過表達(dá)基因細(xì)胞系的方法,建立穩(wěn)定過表達(dá) MGST1 的 SPC-A-1 細(xì)胞系,Real-time QPCR 檢測 MGST1 mRNA 的表達(dá)水平、Western-blot檢測MGST1蛋白的表達(dá)水平、MTS檢測增殖活性、克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測克隆形成能力、流式細(xì)胞儀檢測H2O2誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、Western-blot檢測相關(guān)凋亡蛋白變化。研究結(jié)果:1.MGST1蛋白在肺上皮細(xì)胞系及肺腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況●Western-blot結(jié)果顯示:MGST1蛋白在肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)水平均比肺上皮細(xì)胞BEAS-2B高,且以H1975、PC-9、XLA-07細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較高,SPC-A-1、H2342、A549細(xì)胞表達(dá)相對(duì)較低。根據(jù)基礎(chǔ)表達(dá)情況,后期選擇PC-9作為慢病毒干擾MGST1的細(xì)胞系,SPC-A-1作為構(gòu)建穩(wěn)定過表達(dá)MGST1的細(xì)胞系。2.慢病毒干擾PC-9細(xì)胞MGST1的表達(dá)后,促進(jìn)PC-9細(xì)胞凋亡● MGST1干擾慢病毒感染PC-9細(xì)胞后,Western-blot結(jié)果顯示:MGST1蛋白表達(dá)顯著減少,表明感染慢病毒成功發(fā)揮干擾蛋白表達(dá)的作用;● MTS結(jié)果顯示:干擾MGST1的表達(dá)后,PC-9細(xì)胞增殖活性受到明顯抑制;●克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干擾MGST1的表達(dá)后,PC-9細(xì)胞克隆形成能力明顯被抑制;●流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:干擾MGST1的表達(dá)后,PC-9細(xì)胞凋亡顯著增加;●Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:干擾PC-9細(xì)胞的MGST1表達(dá)后,凋亡蛋白 caspase 9、caspase 3、PARP 表達(dá)降低,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP 表達(dá)明顯升高。3.SPC-A-1細(xì)胞過表達(dá)MGST1基因后,抑制H2O2誘導(dǎo)SPC-A-1細(xì)胞的凋亡●測序鑒定MGST1過表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功,Real-time QPCR和Western-blot結(jié)果驗(yàn)證MGST1在穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系SPC-A-1中轉(zhuǎn)錄和蛋白水平表達(dá)均升高,表明穩(wěn)定過表達(dá)MGST1的SPC-A-1細(xì)胞系成功建立;● MTS結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因后,SPC-A-1細(xì)胞的增殖活性明顯增加;●克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因后,SPC-A-1細(xì)胞克隆形成能力明顯增強(qiáng);●流式細(xì)胞儀檢測凋亡結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達(dá)MGST1基因后,H202誘導(dǎo)的SPC-A-1細(xì)胞凋亡顯著減少;●Western-blot檢測凋亡相關(guān)蛋白結(jié)果顯示:穩(wěn)定過表達(dá)SPC-A-1細(xì)胞MGST1基因后,H2O2誘導(dǎo)的SPC-A-1細(xì)胞凋亡蛋白caspase 9、caspase 3、PARP表達(dá)增多,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP 表達(dá)明顯減少。結(jié)論:通過本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),MGST1可通過抑制caspase凋亡蛋白9、3、PARP發(fā)揮抑制肺腺癌細(xì)胞凋亡的作用。
[Abstract]:Objective : To study the mechanism of MGST1 expression in lung adenocarcinoma cell line SPC - A - 1 銆，

本文編號(hào)：1470382