發(fā)布時間：2018-01-28 09:25

  本文關鍵詞： 肺腺癌 MGST1 細胞凋亡 caspase　出處：《南方醫(yī)科大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景:肺癌是最常見的惡性腫瘤之一,發(fā)病率和死亡率在我國及全世界均高居首位。肺腺癌是肺癌最常見的組織類型之一,發(fā)現時常處于晚期,預后較差。近年雖在分子機制研究上取得較大進展,但其發(fā)病機制遠未闡明。因此研究肺腺癌的致病驅動基因,探尋肺腺癌新的治療靶基因具有重大意義。研究表明,MGST1與食管癌、上皮性卵巢癌、前列腺癌等多種腫瘤發(fā)生發(fā)展過程密切相關,且在轉基因小鼠肺癌中高表達,但其在肺癌中所發(fā)揮的功能和作用機制研究尚未見報道。我們前期研究發(fā)現MGST1在人肺腺癌組織標本中高表達,抑制肺腺癌細胞A549中MGST1的表達后,可抑制細胞增殖活性,促進細胞凋亡的發(fā)生,但機制尚未闡明。因此,闡明MGST1促進肺腺癌凋亡的作用機制有待進一步研究,MGST1有望成為肺腺癌新候選治療靶基因。研究目的:本實驗運用慢病毒干擾肺腺癌細胞系PC-9內源性MGST1的表達和過表達質粒轉染肺腺癌細胞系SPC-A-1增加外源性MGST1的表達,從正反兩方面初步研究MGST1在肺腺癌細胞中發(fā)揮的生物學功能,并進行機制探討,旨在獲得MGST1在肺腺癌惡性進程中發(fā)揮重要作用的可靠實驗證據,為MGST1成為肺腺癌新候選治療靶基因提供科學依據。研究方法:本實驗運用Western-blot檢測肺上皮細胞系BEAS-2B及肺腺癌細胞系SPC-A-1、H2342、A549、H1975、PC-9、XLA-07 中 MGST1 蛋白的基礎表達水平,并選擇PC-9及SPC-A-1作為后期研究的工具細胞;運用慢病毒感染肺腺癌PC-9細胞,干擾內源性MGST1的表達,Western-blot驗證干擾效果、MTS檢測增殖活性、克隆形成實驗檢測克隆形成能力、流式細胞儀檢測細胞凋亡、Western-blot檢測相關凋亡蛋白變化;運用構建重組質粒和轉染篩選穩(wěn)定過表達基因細胞系的方法,建立穩(wěn)定過表達 MGST1 的 SPC-A-1 細胞系,Real-time QPCR 檢測 MGST1 mRNA 的表達水平、Western-blot檢測MGST1蛋白的表達水平、MTS檢測增殖活性、克隆形成實驗檢測克隆形成能力、流式細胞儀檢測H2O2誘導細胞凋亡、Western-blot檢測相關凋亡蛋白變化。研究結果:1.MGST1蛋白在肺上皮細胞系及肺腺癌細胞系中的表達情況●Western-blot結果顯示:MGST1蛋白在肺腺癌細胞中的表達水平均比肺上皮細胞BEAS-2B高,且以H1975、PC-9、XLA-07細胞表達相對較高,SPC-A-1、H2342、A549細胞表達相對較低。根據基礎表達情況,后期選擇PC-9作為慢病毒干擾MGST1的細胞系,SPC-A-1作為構建穩(wěn)定過表達MGST1的細胞系。2.慢病毒干擾PC-9細胞MGST1的表達后,促進PC-9細胞凋亡● MGST1干擾慢病毒感染PC-9細胞后,Western-blot結果顯示:MGST1蛋白表達顯著減少,表明感染慢病毒成功發(fā)揮干擾蛋白表達的作用;● MTS結果顯示:干擾MGST1的表達后,PC-9細胞增殖活性受到明顯抑制;●克隆形成實驗結果顯示:干擾MGST1的表達后,PC-9細胞克隆形成能力明顯被抑制;●流式細胞儀檢測凋亡結果顯示:干擾MGST1的表達后,PC-9細胞凋亡顯著增加;●Western-blot檢測凋亡相關蛋白結果顯示:干擾PC-9細胞的MGST1表達后,凋亡蛋白 caspase 9、caspase 3、PARP 表達降低,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP 表達明顯升高。3.SPC-A-1細胞過表達MGST1基因后,抑制H2O2誘導SPC-A-1細胞的凋亡●測序鑒定MGST1過表達質粒構建成功,Real-time QPCR和Western-blot結果驗證MGST1在穩(wěn)轉細胞系SPC-A-1中轉錄和蛋白水平表達均升高,表明穩(wěn)定過表達MGST1的SPC-A-1細胞系成功建立;● MTS結果顯示:穩(wěn)定過表達MGST1基因后,SPC-A-1細胞的增殖活性明顯增加;●克隆形成實驗結果顯示:穩(wěn)定過表達MGST1基因后,SPC-A-1細胞克隆形成能力明顯增強;●流式細胞儀檢測凋亡結果顯示:穩(wěn)定過表達MGST1基因后,H202誘導的SPC-A-1細胞凋亡顯著減少;●Western-blot檢測凋亡相關蛋白結果顯示:穩(wěn)定過表達SPC-A-1細胞MGST1基因后,H2O2誘導的SPC-A-1細胞凋亡蛋白caspase 9、caspase 3、PARP表達增多,cleaved-caspase 9、cleaved-caspase 3、cleaved-PARP 表達明顯減少。結論:通過本實驗研究發(fā)現,MGST1可通過抑制caspase凋亡蛋白9、3、PARP發(fā)揮抑制肺腺癌細胞凋亡的作用。
[Abstract]:Objective : To study the mechanism of MGST1 expression in lung adenocarcinoma cell line SPC - A - 1 銆，

本文編號：1470382