發(fā)布時(shí)間：2018-01-28 08:02

  本文關(guān)鍵詞： 紫外線 miR-664 黑色素瘤 自噬 凋亡 交互調(diào)控　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：黑色素瘤(Cutaneous Malignant Melanoma,CMM),又稱惡性黑色素瘤,來(lái)源于黑素細(xì)胞,呈高侵襲性,易出現(xiàn)遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)移。紫外線是造成皮膚表層細(xì)胞DNA損傷的主要的物理因素之一,也是誘發(fā)黑色素瘤的明確病因之一。自噬(Autophagy)與凋亡(Apoptosis)是細(xì)胞內(nèi)兩種程序性死亡方式。細(xì)胞自噬性降解可維持生理狀態(tài)下機(jī)體的穩(wěn)態(tài),過(guò)度自噬引起的自噬失調(diào)與腫瘤、感染、神經(jīng)退行性變等疾病相關(guān)。凋亡是通過(guò)激活內(nèi)源性DNA內(nèi)切酶而誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡過(guò)程。惡性黑色素瘤的發(fā)生、發(fā)展通常與細(xì)胞凋亡基因調(diào)控失常而導(dǎo)致凋亡障礙有關(guān)。自噬與凋亡作為兩種調(diào)控方式共同存在于細(xì)胞內(nèi),二者共同的調(diào)控因子使二者可以發(fā)生相互轉(zhuǎn)化,從而決定細(xì)胞的命運(yùn)。MicroRNA通過(guò)降解靶基因參與自噬與凋亡的調(diào)控。因此深入研究UVB的輻射損傷機(jī)制及microRNA在其中的作用,能為預(yù)防和靶向治療黑色素瘤提供重要依據(jù)。研究目的探討中波紫外線(UVB)和模擬日光紫外線對(duì)A375細(xì)胞自噬、凋亡的影響,以及自噬與凋亡相互調(diào)控來(lái)分析紫外線對(duì)黑色素瘤A375細(xì)胞的生存能力等生物學(xué)功能改變,并初步探討microRNA-664在相互調(diào)控中的作用機(jī)制。研究方法用不同劑量的UVB(功率密度:165 μW/cm2)照射A375細(xì)胞,在照后不同時(shí)間點(diǎn)雙熒光自噬慢病毒監(jiān)測(cè)10、30、50mJ/cm2UVB照后A375細(xì)胞自噬情況的變化;CCK-8法檢測(cè)增殖變化;流氏細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞凋亡及周期變化;qPCR檢測(cè)miR-664的表達(dá);Western Blot分析自噬、凋亡、周期、DNA損傷等生物學(xué)功能標(biāo)志蛋白變化。模擬不同劑量日光照射(UVA:UVB=95:5,UVA功率密度為118μW/cm2),觀察照后不同時(shí)間點(diǎn)A375細(xì)胞自噬、凋亡變化,并分析相應(yīng)的生物學(xué)功能標(biāo)志蛋白變化。研究結(jié)果(1)UVB 照射:1)0～50mJ/cm2的UVB照射,對(duì)A375細(xì)胞自噬誘導(dǎo)的能力呈先增高后降低的拋物線趨勢(shì),30mJ/ccm2最強(qiáng)。10、30mJ/cm2照射后,自噬體數(shù)量在0～6h內(nèi)逐漸增多,9h開(kāi)始減少。相應(yīng)地,LC3、Beclin1在0～50mJ/cm2UVB照后表達(dá)先增加后減少,10、30mJ/cm2組蛋白表達(dá)在0～6h逐漸增加,9h表達(dá)減少;2)UVB照射時(shí),10、30mJ/cm2照后均有凋亡高峰(9h)延遲于自噬高峰出現(xiàn)(6h),且在自噬最強(qiáng)時(shí)有凋亡標(biāo)志蛋白表達(dá)被抑制;3)10、30mJ/cm2的UVB照射A375細(xì)胞后,細(xì)胞增殖能力均有照后0～6h逐漸增強(qiáng),9h開(kāi)始減弱的趨勢(shì),但兩個(gè)劑量增減幅度不同。1OmJ/cm2照射后,在0～9h內(nèi),S期細(xì)胞比例增多,對(duì)應(yīng)的CDK4的表達(dá)也呈逐漸增加,且9h達(dá)最大值。30mJ/cm2照射組,未見(jiàn)細(xì)胞周期的明顯改變。在照后24h后細(xì)胞均表現(xiàn)為存活。(2)模擬日光紫外照射:1)不同劑量(10、30、50mJ/cm2)照后均可誘導(dǎo)A375細(xì)胞產(chǎn)生自噬,10、30mJ/cm2照射,自噬體在0～6h內(nèi)逐漸增多,9h開(kāi)始下降,50mJ/cm2模擬日光照射后自噬體在3h即可形成,在觀察時(shí)間內(nèi)均維持較高自噬水平。與之對(duì)應(yīng)的,10、30mJ/cm2組LC3、Beclin1表達(dá)在6h才出現(xiàn)顯著增加,而50 mJ/cm2組在3h已顯著增加,6～12h持續(xù)高表達(dá);2)單純UVA、單純UVB及模擬日光紫外照射方式分別照射A375細(xì)胞后,三者對(duì)自噬誘導(dǎo)能力的由強(qiáng)到弱依次為:模擬照射單獨(dú)UVB照射單獨(dú)UVA照射;3)30mJ/cm2模擬日光紫外照射A375細(xì)胞后,凋亡高峰(照后9h)延遲于自噬高峰(照后6h)出現(xiàn),且自噬高峰有凋亡蛋白Caspase3/9的表達(dá)降低。抑制自噬后,6h、9h凋亡蛋白Caspase3/9表達(dá)增加。(3)較于黑素原代細(xì)胞,miR-664在A375細(xì)胞中呈低表達(dá),上調(diào)miR-664后,UVRAG、Beclin-1表達(dá)降低,Atg5、Atg12表達(dá)量上升,BAX及Bcl-2無(wú)明顯變化。研究結(jié)論1.10、30mJ/cm2的UVB照射,誘導(dǎo)A375細(xì)胞產(chǎn)生的自噬促進(jìn)細(xì)胞增殖,對(duì)細(xì)胞呈保護(hù)作用,10mJ/cm2的UVB照射,可誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生S期阻滯;2.UVB或模擬日光紫外照射可誘導(dǎo)A375細(xì)胞產(chǎn)生自噬,UVB是主要貢獻(xiàn)者;3.紫外照射誘導(dǎo)產(chǎn)生的自噬可以延遲凋亡的發(fā)生,促進(jìn)細(xì)胞存活;4.A375細(xì)胞中miR-664的表達(dá)低于黑色素原代細(xì)胞,miR-664可能參與紫外誘導(dǎo)A375細(xì)胞自噬與凋亡相互調(diào)控。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R739.5

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1470207