本文關(guān)鍵詞： 表皮生長因子受體 納米抗體D 免疫毒素 銅綠假單胞菌外毒素PEKDEL　出處：《中國免疫學(xué)雜志》2017年04期 　論文類型：期刊論文

【摘要】：目的:構(gòu)建基于EGFR納米抗體的免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,并檢測其對EGFR腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。方法:采用分子克隆技術(shù),將靶向EGFR的納米抗體7D12以二價的形式,通過柔性連接肽(G4S)4與銅綠假單胞菌外毒素的截斷形式PE38KDEL連接,構(gòu)建原核表達(dá)載體p ET28a-BI7D12-PE38KDEL。然后將其轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞,用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。通過鎳柱親和層析法純化目的蛋白,并經(jīng)Western blot驗證。通過流式細(xì)胞技術(shù)檢測該免疫毒素與EGFR陽性細(xì)胞A549、HT29、MCF-7和EGFR陰性細(xì)胞CEM、Jurkat的結(jié)合能力后,將其按照一定的濃度梯度進(jìn)行細(xì)胞毒實驗研究,72 h后,使用WST-1試劑檢測BI7D12-PE38KDEL對上述細(xì)胞的殺傷效果。結(jié)果:通過SDS-PAGE和Western blot實驗驗證,成功的制備了重組免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,該毒素大部分以可溶性的方式表達(dá)。BI7D12-PE38KDEL能夠與EGFR陽性的A549、HT29、MCF-7腫瘤細(xì)胞特異性的結(jié)合,并且對上述細(xì)胞的細(xì)胞毒作用與陰性對照組CEM和Jurkat相比具有極其顯著性差異(P0.01)。結(jié)論:成功地構(gòu)建了基于EGFR納米抗體的重組免疫毒素BI7D12-PE38KDEL,該免疫毒素能特異性的結(jié)合并殺傷EGFR陽性的腫瘤細(xì)胞。
[Abstract]:Objective: to construct the immunotoxin BI7D12-PE38KDEL based on EGFR nano-antibody and to detect its cytotoxic effect on EGFR tumor cells. Methods: molecular cloning technique was used to detect the cytotoxicity of BI7D12-PE38KDEL to EGFR tumor cells. The nano-antibody 7D12 targeting EGFR was linked with the truncated form of PE38KDEL of Pseudomonas aeruginosa by flexible ligation peptide G4S4 in the form of divalent. The prokaryotic expression vector pET28a-BI7D12-PE38KDELwas constructed and transformed into BL21ODE3) -receptive cells. The expression was induced by IPTG. The target protein was purified by nickel column affinity chromatography. The results were verified by Western blot and detected by flow cytometry. The immunotoxin and EGFR positive cell line A549H T29C MCF-7 and EGFR negative cell CEM were detected by flow cytometry. After the binding ability of Jurkat, the cytotoxicity was studied at a certain concentration gradient for 72 h. WST-1 reagent was used to detect the killing effect of BI7D12-PE38KDEL on the above cells. Results: SDS-PAGE and Western blot experiments were used to verify the effect. Recombinant immunotoxin BI7D12-PE38KDEL was successfully prepared. Most of the toxin expressed in a soluble manner. BI7D12-PE38KDEL can specifically bind to EGFR positive tumor cell line A549 / HT29 / MCF-7. The cytotoxicity of the above cells was significantly different from that of CEM and Jurkat in negative control group (P0.01). Conclusion: recombinant immunotoxin BI7D12-PE38KDEL based on EGFR nano-antibody was successfully constructed. The immunotoxin can specifically bind and kill EGFR positive tumor cells.
【作者單位】： 蘇州大學(xué)唐仲英血液學(xué)研究中心江蘇省血液學(xué)協(xié)同創(chuàng)新中心;西安交通大學(xué)蘇州研究生院;博生吉醫(yī)藥科技(蘇州)有限公司;
【基金】：山東省自然科學(xué)基金資助項目(ZR2015PH029)
【分類號】：R730.51
【正文快照】： EGFR是HER家族中的一員,在大多數(shù)的上皮性腫瘤細(xì)胞上過度表達(dá)。當(dāng)EGFR與其配體結(jié)合后,受體之間發(fā)生同源或異源二聚化,激活下游細(xì)胞信號通路,引起腫瘤細(xì)胞的增殖、轉(zhuǎn)移等[1]。因此,針對EGFR的治療具有特別重要的意義。免疫毒素,作為一種新穎的治療藥物已經(jīng)得到了廣泛的研究。它

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本文編號：1469566