本文關(guān)鍵詞： 結(jié)腸癌 S100P 轉(zhuǎn)移 生存預(yù)后 轉(zhuǎn)錄因子 上皮間質(zhì)變　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：雖然結(jié)腸癌診療技術(shù)取得了長足的實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展,但是伴有轉(zhuǎn)移或是無法根治性切除結(jié)腸癌患者的長期生存率并無法令人滿意。結(jié)腸癌作為全球常見惡性腫瘤之一,每年近120萬人被診斷為新發(fā)病例,并且每年約60萬人死于結(jié)腸癌。結(jié)腸癌成為了全球第四致死性惡性腫瘤。其中腫瘤復(fù)發(fā)及轉(zhuǎn)移是造成目前狀況的主要原因。因此,探尋結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中轉(zhuǎn)移相關(guān)關(guān)鍵分子；尋找腫瘤轉(zhuǎn)移診斷生物分子標(biāo)記物,為腫瘤個性化治療提供參考依據(jù)；闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過程中的相關(guān)分子調(diào)控機(jī)制,為腫瘤治療靶點(diǎn)提供理論依據(jù)。是當(dāng)今腫瘤研究的熱點(diǎn),也是提高人類對惡性腫瘤的認(rèn)識,并改善腫瘤患者生存及預(yù)后的必經(jīng)之路。腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移是一個多階段,多步驟,并由多種基因及信號通路共同參與的復(fù)雜過程。目前針對胃腸道腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的主要學(xué)說有：1、直接侵襲：侵襲性較強(qiáng)的腫瘤細(xì)胞突破基底膜直接蔓延到鄰近部位；2、淋巴轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞進(jìn)入淋巴循環(huán)內(nèi),通過淋巴管由近及遠(yuǎn)轉(zhuǎn)移到各級淋巴結(jié)。除此之外,腫瘤直接轉(zhuǎn)移至較遠(yuǎn)淋巴結(jié)的跳躍式轉(zhuǎn)移也時�？梢�；淋巴結(jié)的腫瘤侵襲情況將直接影響患者的腫瘤分期,對病情及預(yù)后的評估極為重要；3、血行轉(zhuǎn)移：腫瘤細(xì)胞代謝較正常細(xì)胞顯著加大,這促進(jìn)了瘤體內(nèi)部新生血管的形成。腫瘤細(xì)胞可脫離瘤體進(jìn)入血管,并隨血流轉(zhuǎn)移至遠(yuǎn)隔部位如肝、骨、肺、腦等處,形成轉(zhuǎn)移瘤灶；4、種植：對于胃腸道腫瘤往往起源于粘膜層,隨著病情的進(jìn)展,腫瘤最終可突破漿膜層,腫瘤細(xì)胞脫落并種植到腹腔內(nèi)其他器官表面,如腹膜或卵巢上。大量研究證實(shí),發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織與未發(fā)生轉(zhuǎn)移的腫瘤組織存在大量差異性表達(dá)基因。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,由于這些差異性表達(dá)的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因?qū)е铝?腫瘤細(xì)胞的代謝、運(yùn)動能力、粘附性及外分泌蛋白出現(xiàn)了改變,從而導(dǎo)致了腫瘤細(xì)胞較高的侵襲性與轉(zhuǎn)移性。在前期研究中。我們以伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本為研究對象,利用基因芯片技術(shù),將伴隨遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織與未發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的結(jié)腸癌組織進(jìn)行了基因表達(dá)差異的比對。最終篩選出差異表達(dá)基因217個。其中轉(zhuǎn)移性結(jié)腸癌中表達(dá)上升90個,表達(dá)下降127個。通過生物信息學(xué)分析并利用real-time quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR)及免疫組化驗(yàn)證,我們發(fā)現(xiàn)了S100P、PRDX1、SLPI這3個結(jié)直腸腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)候選基因。其中候選基因S100P隸屬于具有EF手型結(jié)構(gòu)的鈣結(jié)合蛋白S100家族,參與鈣離子依賴性信號傳導(dǎo)。S100P最早發(fā)現(xiàn)于人類胎盤中。S100P是廣泛分布在正常人體組織,包括心臟、腦、肝臟、肺、骨髓和外周血白細(xì)胞。在亞細(xì)胞層面,在多種細(xì)胞的核和細(xì)胞質(zhì)中均可觀測到S100P的表達(dá)。在細(xì)胞內(nèi)S100P通過激活ezrn、CasyBP/SIP等蛋白調(diào)控一系列信號通路。此外,S100P還可外分泌進(jìn)入細(xì)胞間質(zhì),調(diào)節(jié)本體細(xì)胞及周邊細(xì)胞功能。細(xì)胞外的S100P可與細(xì)胞膜表面蛋白RAGE結(jié)合,進(jìn)而使得Erkl/2磷酸化,激活MAPK/ERK通路。研究證實(shí),S100P涉及腫瘤細(xì)胞生長、運(yùn)動、粘附、凋亡等過程。為了進(jìn)一步分析S100P在結(jié)直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用,以及S100P在診斷及預(yù)后預(yù)測方面的臨床價值,闡明S100P在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中所起的作用機(jī)制。本研究分析比較125例腫瘤發(fā)展不同階段結(jié)腸腺癌的臨床手術(shù)標(biāo)本中S100P的表達(dá)差異,結(jié)合臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。并利用S100P敲低穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株分析S100P在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用及其分子機(jī)制。1、免疫組化檢測人結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)本S100P表達(dá)情況腺癌是消化道腫瘤中最為常見多發(fā)的病理類型。為了更好探尋S100P表達(dá)量與結(jié)直腸進(jìn)展及預(yù)后的關(guān)系,我們利用免疫組化技術(shù)對125例不同臨床分期的結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)本及其配對手術(shù)切緣正常結(jié)腸組織進(jìn)行分析。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中S100P表達(dá)量顯著高于正常組織。利用統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)分析腫瘤組織中S100P表達(dá)量與臨床數(shù)據(jù)的相關(guān)性后,我們發(fā)現(xiàn)s100P的表達(dá)高低與患者術(shù)前血中CEA(χ2=9.704,P=0.002)、CA19-9(χ2=5.051,P=0.025),腫瘤大小(χ2=4.098,P=0.043),N分期(χ2=1.033,P=0.309),M分期(χ2=36.863,p0.001),TNM分期(χ2=13.528,P0.001)存在相關(guān)性。在收集患者術(shù)后隨訪信息后,對S100P表達(dá)情況與患者生存時間進(jìn)行生存分析后,我們發(fā)現(xiàn)S100P高表達(dá)的患者預(yù)后顯著低于S100P低表達(dá)的患者(χ2=30.080,P0.001)。通過建立多因素COX風(fēng)險預(yù)測模型,對S100P表達(dá)量與不同臨床數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析后,結(jié)果顯示S100P(hazards ratiio,HR=2.697,P0.001)、TNM分期(HR=3.678,P0.001)可被視為患者預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。S100P在腫瘤中的高表達(dá)預(yù)示著腫瘤較高的轉(zhuǎn)移能力以及不良預(yù)后。為了進(jìn)一步驗(yàn)證S100P基因在結(jié)腸癌組織中的表達(dá)情況,我們利用Q-PCR和Western blot技術(shù)對臨床結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本中S100P的表達(dá)量進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,在結(jié)腸癌組織中S100P基因的mRNA表達(dá)量約為正常組織中的3倍之多(t=7.704,P0.001),結(jié)腸癌組織中S100P蛋白表達(dá)量亦是顯著高于正常結(jié)直腸組織(t=4.739,P=0.018)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果與免疫組化所觀察到的現(xiàn)象一致,一定程度上證明了S100P在結(jié)腸癌發(fā)生發(fā)展的過程中扮演著一定的角色,S100P是結(jié)腸癌相關(guān)蛋白。也為下一步闡明S100P在結(jié)腸癌中所起作用及其作用機(jī)制奠定了重要理論依據(jù)。2、S100P在結(jié)腸癌中所發(fā)揮的作用為探尋S100P在結(jié)腸癌中的作用機(jī)制,選取合適的體外研究對象,我們對6種不同結(jié)腸癌細(xì)胞系：LS174T、SW480、HCT116、SW620、LOVO、DLD-1的S100P基因及蛋白表達(dá)量進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示LS174T、HCT116、DLD-1相對于SW480、SW620、LOVO為S100P高表達(dá)細(xì)胞株。結(jié)合細(xì)胞狀態(tài)及其生長情況,最終我們選取了S100P高表達(dá)的LS174T、HCT116細(xì)胞株作為我們的研究對象。腫瘤相關(guān)蛋白由于其在腫瘤組織中的表達(dá)差異,所引起其所在調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中其他蛋白及信號通路的變化,進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)展。人為干擾腫瘤相關(guān)蛋白的差異性表達(dá),觀察腫瘤相關(guān)蛋白表達(dá)量恢復(fù)后,細(xì)胞功能較之前的變化,以推斷該蛋白中腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起作用。這是目前研究腫瘤相關(guān)蛋白的一致觀點(diǎn)。本研究利用siRNA干擾技術(shù),設(shè)計(jì)針對S100P mRNA不同的siRNA,通過Q-PCR和Western blot檢測,篩選S100P干擾效率最高的siRNA,并根據(jù)其設(shè)計(jì)表達(dá)S100P-siRNA及綠色熒光(GFP)的慢病毒。利用表達(dá)S100P-siRNA的慢病毒轉(zhuǎn)入結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T、HCT116,構(gòu)建S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T-S100P-KD、HCT116-S100P-KD。利用S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株,在體外對細(xì)胞的侵襲性、遷移性進(jìn)行了檢測。通過對裸鼠的皮下成瘤及腹腔內(nèi)注射,構(gòu)建動物腫瘤模型及腹腔內(nèi)播散模型。觀察S100P表達(dá)在體內(nèi)對結(jié)腸癌細(xì)胞成瘤性及轉(zhuǎn)移性的影響。通過體內(nèi)體外功能實(shí)驗(yàn),我們發(fā)現(xiàn)敲低S100P后,HCT116、LS174T細(xì)胞株的遷移能力(HCT116:t=5.868,P=0.004；LS174T:t=4.806,P=0.009)、侵襲性(HCT116:t=5.126,P=0.007:LS174T:t=2.933,P=0.043)與成瘤性(HCT116:t=2:794,P=0.049；LS174T:t=3.445,P=0.026)均顯著下降,在裸鼠腹腔內(nèi)播散種植病灶也較對照組減少。3、S100P促進(jìn)結(jié)腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)分子機(jī)制的初步探討研究表明,S100P可外分泌至細(xì)胞間質(zhì),再與細(xì)胞膜表面蛋白RAGE結(jié)合,繼而激活下游MAPK/ERK信號通路,使得Erkl/2磷酸化,從而影響細(xì)胞的生物學(xué)功能。另有報道證實(shí),MAPK/ERK信號通路與腫瘤細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變(EMT)存在密切聯(lián)系。而EMT是腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中的重要機(jī)制之一,也是當(dāng)今腫瘤分子機(jī)制研究的熱門。在研究過程中,S100P與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力密切相關(guān)。據(jù)此,我們提出假設(shè)：S100P通過與細(xì)胞膜蛋白RAGE結(jié)合,激活Erk1/2磷酸化,進(jìn)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的EMT過程,從而影響結(jié)腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移。利用構(gòu)建的S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株LS174T-S100P-KD、 HCT116-S100P-KD,通過Western blot檢測S100P敲低的穩(wěn)轉(zhuǎn)結(jié)腸癌細(xì)胞株及陰性對照細(xì)胞株中S100P、RAGE、Erkl/2、p-Erkl/2、上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin、間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、Sn ail的表達(dá)差異。在敲低S100P表達(dá)量后,相比未敲低S100P的陰性對照組,細(xì)胞株中RAGE及磷酸化Erk1/2的表達(dá)量隨之下降,腫瘤細(xì)胞株的上皮細(xì)胞標(biāo)記物E-cadherin表達(dá)量也出現(xiàn)下降,而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)記物N-cadherin、Vimentin、Snail的表達(dá)量則出現(xiàn)了上升。初步證實(shí)了,S100P激活RAGE/ERK信號通路,促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的EMT過程。4、篩選及驗(yàn)證S100P上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子基因的表達(dá)受到體內(nèi)多種方式的調(diào)控,其中基因表達(dá)調(diào)控主要發(fā)生于轉(zhuǎn)錄過程中,調(diào)控過程圍繞著轉(zhuǎn)錄過程,如轉(zhuǎn)錄前調(diào)控、轉(zhuǎn)錄調(diào)控以及轉(zhuǎn)錄后調(diào)控。真核生物基因表達(dá)轉(zhuǎn)錄需要多種蛋白因子協(xié)助,其中轉(zhuǎn)錄因子(transcription factor, TF)是一群能與DNA特定序列特異性結(jié)合,從而促進(jìn)或是抑制目的基因表達(dá)的蛋白質(zhì)分子,是轉(zhuǎn)錄調(diào)控中的關(guān)鍵因子。經(jīng)驗(yàn)證S100P基因在結(jié)腸癌中相比正常組織的高表達(dá),是否存在異常表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子導(dǎo)致了S100P基因的過表達(dá)。為進(jìn)一步探索S100P在結(jié)腸癌中過表達(dá)的原因,我們對S100P上游調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行了探索及預(yù)測。在對S100P基因啟動子進(jìn)行檢索后,利用JASPAR轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測軟件(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)對S100P基因可能的轉(zhuǎn)錄因子及其轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。在眾多預(yù)測結(jié)果中,我們挑取評分較高的候選轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行文獻(xiàn)調(diào)研并檢測其在結(jié)腸癌組織與正常結(jié)直腸組織中的表達(dá)情況。最終,我們將目標(biāo)鎖定在SOX9蛋白上。SOX (sex determining region Y box)家族是具有HMG盒(high mobility groupbox)的一類與性腺發(fā)育有關(guān)的核轉(zhuǎn)錄因子,包括A～J10個亞家族。研究發(fā)現(xiàn),SOX家族與癌癥發(fā)生有密切聯(lián)系,包括黑色素瘤、胃癌、髓母細(xì)胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。SOX9最早是從一種性別反轉(zhuǎn)畸形的遺傳性疾病患者中克隆得到。近來,SOX9與腫瘤的關(guān)系也開始受到關(guān)注。為驗(yàn)證SOX9為S100P的轉(zhuǎn)錄因子,我們首先檢測SOX9與S100P在相同結(jié)腸癌組織及細(xì)胞系中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明,SOX9與S100P在結(jié)腸癌組織中均為表達(dá)升高,在高表達(dá)S100P的結(jié)腸癌細(xì)胞株中SOX9也相應(yīng)的高表達(dá),兩者存在一定相關(guān)性。接著我們利用凝膠電泳遷移實(shí)驗(yàn)(EMSA)、定量染色質(zhì)免疫共沉淀(Q-ChIP)技術(shù)(HCT116:t=3.871,P=0.018:LS174T:t=2.889,P=0.016)、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測LS174T、HCT116細(xì)胞株中SOX9與S100P基因的特異性結(jié)合情況。我們利用siRNA技術(shù)特異性干擾LS174T、HCT116細(xì)胞株SOX9表達(dá)后,觀察S100P基因表達(dá)的變化情況。在SOX9被敲低后,S100P基因及蛋白表達(dá)也隨之出現(xiàn)下降。證明了SOX9是S100P基因的轉(zhuǎn)錄因子,并且SOX9表達(dá)可以調(diào)控S100P基因的表達(dá)。此外,我們還運(yùn)用免疫熒光共聚焦技術(shù)觀察SOX9在LS174T、HCT116細(xì)胞株中表達(dá)定位情況,SOX9在細(xì)胞漿及細(xì)胞核中均有表達(dá),這也從側(cè)面反映了SOX9作為轉(zhuǎn)錄因子的可能性。5、SOX9與S100P在結(jié)腸癌中表達(dá)情況的相關(guān)性分析及其在腫瘤進(jìn)展中所起的作用SOX9作為S100P轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控S100P轉(zhuǎn)錄表達(dá),SOX9在結(jié)腸癌中的表達(dá)情況應(yīng)影響S100P的表達(dá)。為了驗(yàn)證這一理論設(shè)想,我們利用組織芯片免疫組化技術(shù)分析90例人結(jié)腸腺癌手術(shù)標(biāo)本中SOX9及S100P的表達(dá)情況,并利用統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行線性回歸分析。結(jié)果顯示在結(jié)腸癌手術(shù)標(biāo)本中,SOX9與S100P的表達(dá)量存在線性回歸(R2=0.782,F=315.459,P0.001),SOX9高表達(dá)的病例中存在S100P高表達(dá)的現(xiàn)象,兩者存在線性關(guān)系。此外,高表達(dá)SOX9及高表達(dá)S100P的病例預(yù)后顯著差于低表達(dá)組。我們還構(gòu)建了SOX9干擾細(xì)胞株、SOX9過表達(dá)細(xì)胞株、SOX9過表達(dá)及S100P干擾細(xì)胞株以及各自的陰性對照。通過對SOX9不同表達(dá)量細(xì)胞株進(jìn)行Westernblot檢測,我們發(fā)現(xiàn)結(jié)腸癌細(xì)胞中高表達(dá)的SOX9通過轉(zhuǎn)錄調(diào)控S100P,導(dǎo)致S100P表達(dá)量的升高,過表達(dá)的S100P進(jìn)而激活MAPK/ERK信號通路,促進(jìn)腫瘤EMT的過程,從而影響腫瘤的侵襲與轉(zhuǎn)移能力。在過表達(dá)SOX9的同時,若敲低S100P的表達(dá),則可逆轉(zhuǎn)這個過程,MAPK/ERK信號通路及EMT過程仍處于抑制狀態(tài),腫瘤細(xì)胞的侵襲(t=6.309,P=0.001)和轉(zhuǎn)移(t=4.769,P=0.003)能力也較SOX9過表達(dá)組大為減弱。裸鼠動物模型進(jìn)一步證實(shí)了體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果。結(jié)論：1、S100P在結(jié)腸癌組織中相比正常結(jié)直腸組織高表達(dá)。在結(jié)腸腺癌中,S100P的表達(dá)量與患者血液中CEA、CA19-9的水平、瘤體大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移及TNM臨床分期相關(guān)。S100P表達(dá)量、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況可被視為患者生存預(yù)后的獨(dú)立預(yù)測因子。S100P高表達(dá)預(yù)示著腫瘤較強(qiáng)的轉(zhuǎn)移能力及不良預(yù)后。2、S100P促進(jìn)結(jié)腸癌細(xì)胞株的侵襲、轉(zhuǎn)移及成瘤能力。3、S100P通過激活RAGE/ERK信號通路,繼而促進(jìn)結(jié)腸癌的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)變過程,從而影響腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)功能。4、SOX9是S100P基因的轉(zhuǎn)錄因子,在結(jié)腸癌組織中高表達(dá),是導(dǎo)致S100P結(jié)腸癌中高表達(dá)的原因之一。通過干擾SOX9表達(dá),可以影響S100P的表達(dá),SOX9對S100P基因的表達(dá)具有調(diào)控作用。5、SOX9與S100P在人結(jié)腸組織中表達(dá)滿足線性回歸,SOX9高表達(dá)的病例也存在S100P的高表達(dá)。高表達(dá)的SOX9及S100P預(yù)示著不良的預(yù)后。SOX9轉(zhuǎn)錄調(diào)控S100P的表達(dá),表達(dá)升高的S100P激活MAPK/ERK信號通路,促進(jìn)EMT進(jìn)展,影響結(jié)腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。S100P在SOX9促進(jìn)結(jié)腸癌的侵襲與轉(zhuǎn)移的過程中是必不可少的關(guān)鍵蛋白。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
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本文編號：1469338