本文關鍵詞： 結腸癌 S100P 轉移 生存預后 轉錄因子 上皮間質變　出處：《南方醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：雖然結腸癌診療技術取得了長足的實質性的進展,但是伴有轉移或是無法根治性切除結腸癌患者的長期生存率并無法令人滿意。結腸癌作為全球常見惡性腫瘤之一,每年近120萬人被診斷為新發(fā)病例,并且每年約60萬人死于結腸癌。結腸癌成為了全球第四致死性惡性腫瘤。其中腫瘤復發(fā)及轉移是造成目前狀況的主要原因。因此,探尋結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中轉移相關關鍵分子；尋找腫瘤轉移診斷生物分子標記物,為腫瘤個性化治療提供參考依據；闡明腫瘤發(fā)生發(fā)展及轉移過程中的相關分子調控機制,為腫瘤治療靶點提供理論依據。是當今腫瘤研究的熱點,也是提高人類對惡性腫瘤的認識,并改善腫瘤患者生存及預后的必經之路。腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉移是一個多階段,多步驟,并由多種基因及信號通路共同參與的復雜過程。目前針對胃腸道腫瘤遠處轉移的主要學說有：1、直接侵襲：侵襲性較強的腫瘤細胞突破基底膜直接蔓延到鄰近部位；2、淋巴轉移：腫瘤細胞進入淋巴循環(huán)內,通過淋巴管由近及遠轉移到各級淋巴結。除此之外,腫瘤直接轉移至較遠淋巴結的跳躍式轉移也時常可見；淋巴結的腫瘤侵襲情況將直接影響患者的腫瘤分期,對病情及預后的評估極為重要；3、血行轉移：腫瘤細胞代謝較正常細胞顯著加大,這促進了瘤體內部新生血管的形成。腫瘤細胞可脫離瘤體進入血管,并隨血流轉移至遠隔部位如肝、骨、肺、腦等處,形成轉移瘤灶；4、種植：對于胃腸道腫瘤往往起源于粘膜層,隨著病情的進展,腫瘤最終可突破漿膜層,腫瘤細胞脫落并種植到腹腔內其他器官表面,如腹膜或卵巢上。大量研究證實,發(fā)生轉移的腫瘤組織與未發(fā)生轉移的腫瘤組織存在大量差異性表達基因。在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中,由于這些差異性表達的轉移相關基因導致了,腫瘤細胞的代謝、運動能力、粘附性及外分泌蛋白出現(xiàn)了改變,從而導致了腫瘤細胞較高的侵襲性與轉移性。在前期研究中。我們以伴隨遠處轉移的結腸癌手術標本為研究對象,利用基因芯片技術,將伴隨遠處轉移的結腸癌組織與未發(fā)生遠處轉移的結腸癌組織進行了基因表達差異的比對。最終篩選出差異表達基因217個。其中轉移性結腸癌中表達上升90個,表達下降127個。通過生物信息學分析并利用real-time quantitative polymerase chain reaction (Q-PCR)及免疫組化驗證,我們發(fā)現(xiàn)了S100P、PRDX1、SLPI這3個結直腸腫瘤轉移相關候選基因。其中候選基因S100P隸屬于具有EF手型結構的鈣結合蛋白S100家族,參與鈣離子依賴性信號傳導。S100P最早發(fā)現(xiàn)于人類胎盤中。S100P是廣泛分布在正常人體組織,包括心臟、腦、肝臟、肺、骨髓和外周血白細胞。在亞細胞層面,在多種細胞的核和細胞質中均可觀測到S100P的表達。在細胞內S100P通過激活ezrn、CasyBP/SIP等蛋白調控一系列信號通路。此外,S100P還可外分泌進入細胞間質,調節(jié)本體細胞及周邊細胞功能。細胞外的S100P可與細胞膜表面蛋白RAGE結合,進而使得Erkl/2磷酸化,激活MAPK/ERK通路。研究證實,S100P涉及腫瘤細胞生長、運動、粘附、凋亡等過程。為了進一步分析S100P在結直腸腫瘤發(fā)生發(fā)展中所起的作用,以及S100P在診斷及預后預測方面的臨床價值,闡明S100P在腫瘤轉移過程中所起的作用機制。本研究分析比較125例腫瘤發(fā)展不同階段結腸腺癌的臨床手術標本中S100P的表達差異,結合臨床數(shù)據進行統(tǒng)計學分析。并利用S100P敲低穩(wěn)轉結腸癌細胞株分析S100P在結腸癌發(fā)生發(fā)展過程中所發(fā)揮的作用及其分子機制。1、免疫組化檢測人結腸腺癌手術標本S100P表達情況腺癌是消化道腫瘤中最為常見多發(fā)的病理類型。為了更好探尋S100P表達量與結直腸進展及預后的關系,我們利用免疫組化技術對125例不同臨床分期的結腸腺癌手術標本及其配對手術切緣正常結腸組織進行分析。發(fā)現(xiàn)腫瘤組織中S100P表達量顯著高于正常組織。利用統(tǒng)計學檢驗分析腫瘤組織中S100P表達量與臨床數(shù)據的相關性后,我們發(fā)現(xiàn)s100P的表達高低與患者術前血中CEA(χ2=9.704,P=0.002)、CA19-9(χ2=5.051,P=0.025),腫瘤大小(χ2=4.098,P=0.043),N分期(χ2=1.033,P=0.309),M分期(χ2=36.863,p0.001),TNM分期(χ2=13.528,P0.001)存在相關性。在收集患者術后隨訪信息后,對S100P表達情況與患者生存時間進行生存分析后,我們發(fā)現(xiàn)S100P高表達的患者預后顯著低于S100P低表達的患者(χ2=30.080,P0.001)。通過建立多因素COX風險預測模型,對S100P表達量與不同臨床數(shù)據進行比對分析后,結果顯示S100P(hazards ratiio,HR=2.697,P0.001)、TNM分期(HR=3.678,P0.001)可被視為患者預后的獨立預測因子。S100P在腫瘤中的高表達預示著腫瘤較高的轉移能力以及不良預后。為了進一步驗證S100P基因在結腸癌組織中的表達情況,我們利用Q-PCR和Western blot技術對臨床結腸癌手術標本中S100P的表達量進行了檢測,結果顯示,在結腸癌組織中S100P基因的mRNA表達量約為正常組織中的3倍之多(t=7.704,P0.001),結腸癌組織中S100P蛋白表達量亦是顯著高于正常結直腸組織(t=4.739,P=0.018)。實驗結果與免疫組化所觀察到的現(xiàn)象一致,一定程度上證明了S100P在結腸癌發(fā)生發(fā)展的過程中扮演著一定的角色,S100P是結腸癌相關蛋白。也為下一步闡明S100P在結腸癌中所起作用及其作用機制奠定了重要理論依據。2、S100P在結腸癌中所發(fā)揮的作用為探尋S100P在結腸癌中的作用機制,選取合適的體外研究對象,我們對6種不同結腸癌細胞系：LS174T、SW480、HCT116、SW620、LOVO、DLD-1的S100P基因及蛋白表達量進行了檢測,結果顯示LS174T、HCT116、DLD-1相對于SW480、SW620、LOVO為S100P高表達細胞株。結合細胞狀態(tài)及其生長情況,最終我們選取了S100P高表達的LS174T、HCT116細胞株作為我們的研究對象。腫瘤相關蛋白由于其在腫瘤組織中的表達差異,所引起其所在調控網絡中其他蛋白及信號通路的變化,進而導致腫瘤的發(fā)展。人為干擾腫瘤相關蛋白的差異性表達,觀察腫瘤相關蛋白表達量恢復后,細胞功能較之前的變化,以推斷該蛋白中腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所起作用。這是目前研究腫瘤相關蛋白的一致觀點。本研究利用siRNA干擾技術,設計針對S100P mRNA不同的siRNA,通過Q-PCR和Western blot檢測,篩選S100P干擾效率最高的siRNA,并根據其設計表達S100P-siRNA及綠色熒光(GFP)的慢病毒。利用表達S100P-siRNA的慢病毒轉入結腸癌細胞株LS174T、HCT116,構建S100P敲低的穩(wěn)轉結腸癌細胞株LS174T-S100P-KD、HCT116-S100P-KD。利用S100P敲低的穩(wěn)轉結腸癌細胞株,在體外對細胞的侵襲性、遷移性進行了檢測。通過對裸鼠的皮下成瘤及腹腔內注射,構建動物腫瘤模型及腹腔內播散模型。觀察S100P表達在體內對結腸癌細胞成瘤性及轉移性的影響。通過體內體外功能實驗,我們發(fā)現(xiàn)敲低S100P后,HCT116、LS174T細胞株的遷移能力(HCT116:t=5.868,P=0.004；LS174T:t=4.806,P=0.009)、侵襲性(HCT116:t=5.126,P=0.007:LS174T:t=2.933,P=0.043)與成瘤性(HCT116:t=2:794,P=0.049；LS174T:t=3.445,P=0.026)均顯著下降,在裸鼠腹腔內播散種植病灶也較對照組減少。3、S100P促進結腸癌轉移相關分子機制的初步探討研究表明,S100P可外分泌至細胞間質,再與細胞膜表面蛋白RAGE結合,繼而激活下游MAPK/ERK信號通路,使得Erkl/2磷酸化,從而影響細胞的生物學功能。另有報道證實,MAPK/ERK信號通路與腫瘤細胞的上皮間質轉變(EMT)存在密切聯(lián)系。而EMT是腫瘤細胞侵襲轉移過程中的重要機制之一,也是當今腫瘤分子機制研究的熱門。在研究過程中,S100P與腫瘤的侵襲轉移能力密切相關。據此,我們提出假設：S100P通過與細胞膜蛋白RAGE結合,激活Erk1/2磷酸化,進而促進腫瘤細胞的EMT過程,從而影響結腸癌的侵襲與轉移。利用構建的S100P敲低的穩(wěn)轉結腸癌細胞株LS174T-S100P-KD、 HCT116-S100P-KD,通過Western blot檢測S100P敲低的穩(wěn)轉結腸癌細胞株及陰性對照細胞株中S100P、RAGE、Erkl/2、p-Erkl/2、上皮細胞標記物E-cadherin、間質細胞標記物N-cadherin、Vimentin、Sn ail的表達差異。在敲低S100P表達量后,相比未敲低S100P的陰性對照組,細胞株中RAGE及磷酸化Erk1/2的表達量隨之下降,腫瘤細胞株的上皮細胞標記物E-cadherin表達量也出現(xiàn)下降,而間質細胞標記物N-cadherin、Vimentin、Snail的表達量則出現(xiàn)了上升。初步證實了,S100P激活RAGE/ERK信號通路,促進了結腸癌細胞的EMT過程。4、篩選及驗證S100P上游調控轉錄因子基因的表達受到體內多種方式的調控,其中基因表達調控主要發(fā)生于轉錄過程中,調控過程圍繞著轉錄過程,如轉錄前調控、轉錄調控以及轉錄后調控。真核生物基因表達轉錄需要多種蛋白因子協(xié)助,其中轉錄因子(transcription factor, TF)是一群能與DNA特定序列特異性結合,從而促進或是抑制目的基因表達的蛋白質分子,是轉錄調控中的關鍵因子。經驗證S100P基因在結腸癌中相比正常組織的高表達,是否存在異常表達的轉錄因子導致了S100P基因的過表達。為進一步探索S100P在結腸癌中過表達的原因,我們對S100P上游調控轉錄因子進行了探索及預測。在對S100P基因啟動子進行檢索后,利用JASPAR轉錄因子預測軟件(http://jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)對S100P基因可能的轉錄因子及其轉錄因子結合位點進行了預測。在眾多預測結果中,我們挑取評分較高的候選轉錄因子進行文獻調研并檢測其在結腸癌組織與正常結直腸組織中的表達情況。最終,我們將目標鎖定在SOX9蛋白上。SOX (sex determining region Y box)家族是具有HMG盒(high mobility groupbox)的一類與性腺發(fā)育有關的核轉錄因子,包括A～J10個亞家族。研究發(fā)現(xiàn),SOX家族與癌癥發(fā)生有密切聯(lián)系,包括黑色素瘤、胃癌、髓母細胞瘤、卵巢癌、胰腺癌等。SOX9最早是從一種性別反轉畸形的遺傳性疾病患者中克隆得到。近來,SOX9與腫瘤的關系也開始受到關注。為驗證SOX9為S100P的轉錄因子,我們首先檢測SOX9與S100P在相同結腸癌組織及細胞系中的表達情況。實驗結果證明,SOX9與S100P在結腸癌組織中均為表達升高,在高表達S100P的結腸癌細胞株中SOX9也相應的高表達,兩者存在一定相關性。接著我們利用凝膠電泳遷移實驗(EMSA)、定量染色質免疫共沉淀(Q-ChIP)技術(HCT116:t=3.871,P=0.018:LS174T:t=2.889,P=0.016)、雙熒光素酶報告檢測系統(tǒng)檢測LS174T、HCT116細胞株中SOX9與S100P基因的特異性結合情況。我們利用siRNA技術特異性干擾LS174T、HCT116細胞株SOX9表達后,觀察S100P基因表達的變化情況。在SOX9被敲低后,S100P基因及蛋白表達也隨之出現(xiàn)下降。證明了SOX9是S100P基因的轉錄因子,并且SOX9表達可以調控S100P基因的表達。此外,我們還運用免疫熒光共聚焦技術觀察SOX9在LS174T、HCT116細胞株中表達定位情況,SOX9在細胞漿及細胞核中均有表達,這也從側面反映了SOX9作為轉錄因子的可能性。5、SOX9與S100P在結腸癌中表達情況的相關性分析及其在腫瘤進展中所起的作用SOX9作為S100P轉錄因子調控S100P轉錄表達,SOX9在結腸癌中的表達情況應影響S100P的表達。為了驗證這一理論設想,我們利用組織芯片免疫組化技術分析90例人結腸腺癌手術標本中SOX9及S100P的表達情況,并利用統(tǒng)計學方法進行線性回歸分析。結果顯示在結腸癌手術標本中,SOX9與S100P的表達量存在線性回歸(R2=0.782,F=315.459,P0.001),SOX9高表達的病例中存在S100P高表達的現(xiàn)象,兩者存在線性關系。此外,高表達SOX9及高表達S100P的病例預后顯著差于低表達組。我們還構建了SOX9干擾細胞株、SOX9過表達細胞株、SOX9過表達及S100P干擾細胞株以及各自的陰性對照。通過對SOX9不同表達量細胞株進行Westernblot檢測,我們發(fā)現(xiàn)結腸癌細胞中高表達的SOX9通過轉錄調控S100P,導致S100P表達量的升高,過表達的S100P進而激活MAPK/ERK信號通路,促進腫瘤EMT的過程,從而影響腫瘤的侵襲與轉移能力。在過表達SOX9的同時,若敲低S100P的表達,則可逆轉這個過程,MAPK/ERK信號通路及EMT過程仍處于抑制狀態(tài),腫瘤細胞的侵襲(t=6.309,P=0.001)和轉移(t=4.769,P=0.003)能力也較SOX9過表達組大為減弱。裸鼠動物模型進一步證實了體外細胞實驗結果。結論：1、S100P在結腸癌組織中相比正常結直腸組織高表達。在結腸腺癌中,S100P的表達量與患者血液中CEA、CA19-9的水平、瘤體大小、淋巴結轉移、遠處轉移及TNM臨床分期相關。S100P表達量、遠處轉移情況可被視為患者生存預后的獨立預測因子。S100P高表達預示著腫瘤較強的轉移能力及不良預后。2、S100P促進結腸癌細胞株的侵襲、轉移及成瘤能力。3、S100P通過激活RAGE/ERK信號通路,繼而促進結腸癌的上皮間質轉變過程,從而影響腫瘤細胞的生物學功能。4、SOX9是S100P基因的轉錄因子,在結腸癌組織中高表達,是導致S100P結腸癌中高表達的原因之一。通過干擾SOX9表達,可以影響S100P的表達,SOX9對S100P基因的表達具有調控作用。5、SOX9與S100P在人結腸組織中表達滿足線性回歸,SOX9高表達的病例也存在S100P的高表達。高表達的SOX9及S100P預示著不良的預后。SOX9轉錄調控S100P的表達,表達升高的S100P激活MAPK/ERK信號通路,促進EMT進展,影響結腸癌的侵襲及轉移。S100P在SOX9促進結腸癌的侵襲與轉移的過程中是必不可少的關鍵蛋白。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R735.35
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本文編號：1469338