本文關(guān)鍵詞： 肺癌 LOC101929897 IKKβ　出處：《山東大學》2017年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：在全球范圍內(nèi),肺腺癌的發(fā)病率、死亡率均位于癌癥之首,隨著精準醫(yī)療時代的來臨,肺腺癌的研究重點轉(zhuǎn)向基于腫瘤分子特性的靶向治療,因此闡明肺腺癌復雜的分子機制已成為肺腺癌研究的主流趨勢,而關(guān)鍵基因和關(guān)鍵信號途徑異常是肺腺癌分子機制的主要研究對象。且肺腺癌組織細胞多在早期即伴有NF-κB信號途徑的激活[1,2],并與肺腺癌TNM分期和較差的預后密切相關(guān)[2,3]。盡管對于NF-κB信號途徑激活的詳細分子機制尚未完全了解,但通過各種途徑抑制NF-κB可抑制肺腺癌細胞的生長增殖,已被大量實驗證據(jù)證明[4,5]。因此干預NF-κB信號途徑已成為肺腺癌靶向治療的策略之一。lncRNA(long non-coding RNA)是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于 200nt 的 RNA,主要由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄,多具有5'帽和多聚腺苷酸尾,無蛋白質(zhì)編碼功能或僅編碼微肽。因具有相對較長的核苷酸鏈,1ncRNA可在分子內(nèi)折疊形成許多特定復雜的二級空間結(jié)構(gòu),能提供多個與分子結(jié)合的位點,共同發(fā)揮生物學功能,同時也造成了lncRNA復雜多樣的調(diào)節(jié)功能機制[6]。目前僅有少部分lncRNA的結(jié)構(gòu)和功能得到了研究。近年來,關(guān)于lncRNA參與NF-κB信號途徑調(diào)控的研究已陸續(xù)開展。2015年,Krawczyk等鑒定了一個新的lncRNA PACER。通過直接作用,PACER促進抑制型的p50/p50二聚體被激活型的p65/p50二聚體取代,結(jié)合結(jié)構(gòu)基因COX2的啟動子,從而激活該基因轉(zhuǎn)錄[7]。因此lncRNA不僅參與NF-κB信號途徑的調(diào)控,其本身更應看作NF-κB信號網(wǎng)絡(luò)的組成成分,目前這方面的研究剛剛開始,更多l(xiāng)ncRNA和NF-κB信號途徑的關(guān)聯(lián)性有待發(fā)掘。同時,病理情況下,lncRNA本身的表達或功能異�？赡芤餘F-κB信號途徑的功能異常,因此對NF-κB信號途徑相關(guān)lncRNA的篩選鑒定,可能拓展對NF-κB異常激活的分子機制的認識,且為肺腺癌患者的個體化治療提供更多可能的候選靶點。而在肺腺癌中,lncRNA LOC101929897對NF-1κB經(jīng)典途徑的作用還未有人研究。第一部分LOC101929897通過上調(diào)IKKβ活化經(jīng)典NF-κB途徑,促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展的機制研究研究目的:明確lncRNA LOC101929897是否通過上調(diào)并激活I(lǐng)KKβ,進而激活經(jīng)典的NF-κB信號途徑,從而促進肺腺癌的發(fā)生發(fā)展。1、芯片檢測利用芯片檢測三對肺腺癌和癌旁正常組織標本中l(wèi)ncRNA和mRNA表達譜的改變,分析芯片結(jié)果,篩選其中差異表達的lncRNAs,芯片結(jié)果顯示:相比癌旁正常組織,在肺腺癌組織中有585個lncRNA表達上調(diào),有2294個lncRNA表達下調(diào),且有835個mRNA表達上調(diào),有845個mRNA表達下下調(diào),其中,lncRNA LOC101929897 和 IKKβ 表達同步上調(diào)。2、標本驗證提取上述三對肺腺癌和癌旁正常組織標本的總RNA和總蛋白,應用qRT-PCR、Western blotting 驗證 LOC101929897、IKKβ mRNA 的表達水平是否與芯片結(jié)果一致,結(jié)果顯示:肺腺癌組織相較于癌旁正常組織,均呈現(xiàn)LOC101929897和IKKβ的表達同步上調(diào)。3、LOC101929897、IKKβ在肺腺癌細胞中的基礎(chǔ)表達以及NF-κB基礎(chǔ)活性檢測。1)用qRT-PCR、Northern blotting檢測比較多個肺腺癌細胞株與肺正常上皮細胞株的 LOC1 01929897、IKKβ mRNA 表達水平,Western blotting 檢測比較 IKKβ的表達水平,結(jié)果顯示:肺腺癌細胞株相對于肺正常上皮細胞株均呈現(xiàn)IKKβ和LOC101929897的同步上調(diào),且上調(diào)程度與肺腺癌細胞的惡性程度呈正相關(guān)。2)應用報告基因分析和凝膠滯留法(EMSA)檢測比較多個肺腺癌細胞株和肺正常上皮細胞株的NF-κB基礎(chǔ)活性,結(jié)果顯示:NF-κB的活性增強與LOC101929897、IKKβ上調(diào)趨勢一致,且與肺腺癌細胞的惡性程度呈正相關(guān)。4、LOC101929897通過上調(diào)IKKβ激活經(jīng)典的NF-κB信號途徑根據(jù)3的結(jié)果,構(gòu)建LOC101929897及其反義鏈表達載體,設(shè)計合成LOC101929897S的siRNA。選取LOC101929897相對低表達的A549細胞和相對高表達的HCC827細胞,在前者過表達LOC101929897,在后者干擾LOC101929897表達,進行功能獲得和功能缺失分析,qRT-PCR檢測LOC101929897 和 IKKβ mRNA 的表達改變;Western blotting 檢測總 IKKβ、P-IKKβ、總IκBα、P-IκBα的含量變化;EMSA檢測NF-κB的核內(nèi)遷移,結(jié)果顯示:與表達LOC101929897反義鏈的陰性參照相比,過表達LOC101929897的A549細胞,其總IKKβ、pIKKβ升高,總IκBα降低,pIκBα升高,NF-κB核內(nèi)遷移增多;反之,在HCC827細胞敲低LOC101929897的表達,上述結(jié)果與過表達 LOC101929897 相反。5、LOC101929897促進肺腺癌細胞增殖、遷移,抑制凋亡的作用研究在LOC101929897過表達和干擾的肺腺癌細胞中,采用MTT、平板克隆形成實驗、流式細胞技術(shù)、Transwell和劃痕實驗等檢測LOC101929897對肺腺癌細胞增殖能力、克隆形成能力、遷移能力的影響,結(jié)果顯示:與表達LOC101929897反義鏈的陰性參照相比,過表達LOC101929897的A549細胞,增殖、遷移能力增強,細胞周期無明顯變化;反之,在HCC827細胞敲低LOC101929897的表達,細胞增殖、遷移能力減弱,細胞周期無明顯變化。結(jié)論:LOC101929897通過上調(diào)IKKβ活化經(jīng)典NF-κB途徑,從而促進肺腺癌發(fā)生發(fā)展。第二部分初步確定LOC101929897在肺腺癌中上調(diào)IKKβ的分子機制研究目的:初步確定LOC101929897是否作為ceRNA,通過與IKKβ mRNA競爭結(jié)合miR-4741,增強IKKβ mRNA的穩(wěn)定性,從而上調(diào)IKKβ。研究方法和結(jié)果:1、確定LOC101929897對IKKβ的上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平1)亞細胞定位:分別提取肺腺癌細胞A549、H1299和HCC827的細胞核和細胞漿RNA,利用qRT-PCR進行絕對定量,測定LOC101929897在核漿分布比例;利用RNA熒光原位雜交,制備A549、H1299和HCC827細胞涂片,用激光共聚焦顯微鏡檢測LOC101929897的亞細胞定位,結(jié)果顯示:LOC101929897大部分位于細胞漿中,少部分位于細胞核中。2)生物信息學分析:應用 RegRNA2.0、TargetScan7.1 分析 LOC101929897序列,發(fā)現(xiàn)無ORF,包含miR-512-5p和miR-4741應答元件,同時miR-4741也靶向IKKβmRNA。3)用 Act-D 處理 A549、H1299、HCC827 細胞,提取總 RNA,qRT-PCR測定IKKβmRNA的半衰期,結(jié)果顯示:在三種細胞中,A549的IKKβmRNA半衰期時間為 3.4h,H1299 為 8.2h,HCC827 為 13.7h。4)在A549中過表達LOC101929897 24h后,用Act-D處理細胞,提取總RNA,測定IKKβ mRNA的半衰期,結(jié)果顯示:對照組A549中IKKβ mRNA的半衰期時間為3.3h,過表達LOC101929897后,IKKβmRNA的半衰期為8.7h。5)構(gòu)建pGL4.10[luc2]-pIKBKB重組質(zhì)粒,在A549和HCC827中分別以pcDNA3.1(+),非特異性干擾RNA(nc)分別作為陰性參照,在A549中過表達LOC101929897 24h,HCC827 中干擾 LOC101929897 表達 24h 后,再瞬時轉(zhuǎn)染pGL4.10[luc2]-pIKBKB,pRL-TK作為內(nèi)參,測定雙熒光素酶活性,結(jié)果顯示:和陰性對照相比,過表達或者干擾LOC101929897后,兩種細胞中pGL4.10[luc2]-pIKBKB的活性無明顯變化。2、初步判斷 LOC101929897 是一個 ceRNA1)提取 A549、H1299、HCC827 細胞的總 RNA,用 qRT-PCR 檢測 miR-4741和miR-512-5p的相對含量,結(jié)果顯示:在三種細胞中miR-4741無明顯變化;miR-512-5p在A549中含量最高,在HCC827中最低。2)用Act-D處理A549、H1299、HCC827細胞,提取總RNA,測定LOC101929897的半衰期,結(jié)果顯示:A549的LOC101929897半衰期為6.6h,H1299 為 9.3h,HCC827 為 13.7h。3、LOC101929897作為ceRNA的分子機制研究用 miR-512-5p inhibitor 瞬時轉(zhuǎn)染 HCC827,用 miR-512-5p mimics 瞬時轉(zhuǎn)染H1299,提取總 RNA 和總蛋白,用 qRT-PCR 檢測 IKKβ 和 LOC101929897,Western檢測IKKβ蛋白水平,結(jié)果顯示:在HCC827中,IKKβ和LOC101929897含量降低;在H1299中,結(jié)果與之相反。結(jié)論:1、LOC101929897主要位于胞漿,對IKKβ的上調(diào)作用發(fā)生在轉(zhuǎn)錄后水平。2、LOC101929897可能作為內(nèi)源性ceRNA,通過與IKKβmRNA競爭結(jié)合miR4741,增強IKKβmRNA的穩(wěn)定性,從而上調(diào)IKKβ。
[Abstract]:In the global context , the morbidity and mortality of adenocarcinoma of the lung are at the top of the cancer . With the advent of precision medical era , the study of lung adenocarcinoma focuses on targeting therapy based on molecular characteristics of lung cancer . It has been proved that the complex molecular mechanism of lung adenocarcinoma has become the main research object of lung adenocarcinoma . In recent years , the study on the regulation of lncRNA in NF - 魏B signaling pathway has been carried out . In 2015 , Krawczyk et al . have identified a new lncRNA PACER . By the direct action , the PACER promoted the suppressor p50 / p50 dimer to be replaced by the activated p50 / p50 dimer , binding to the promoter of the structural gene COX2 , thus activating transcription of the gene . The expression of lncRNA and NF - 魏B signaling pathway in adenocarcinoma of lung was regulated . The results showed that the expression of lncRNA and the expression of lncRNA and IKK尾 mRNA in lung adenocarcinoma were regulated . The expression of IKK尾 , P - IKK尾 , total I魏B 偽 , P - I魏B 偽 in lung adenocarcinoma cell line and lung adenocarcinoma cell line were detected by Western blotting . In the second part , it was determined whether LOC10192997 was used as ceRNA to enhance the stability of IKK尾 mRNA . The half - life of IKK尾 mRNA in A549 and HCC827 were 3.3h , 8.2h and 13.77.4 respectively . The relative content of miR - 4741 and miR - 512 - 5p was detected by qRT - PCR . The results showed that miR - 4741 had no significant change in the three cells ; the highest content of miR - 512 - 5p in A549 , the lowest in HCC827 .

【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R734.2

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本文編號：1467979