本文關(guān)鍵詞： 肺腺癌 GLC-82 Cav-1 EGFR 增殖 遷移 侵襲 裸鼠　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,已成為癌癥中的第一殺手,嚴(yán)重威脅人類生命健康。每年肺癌新發(fā)病例超過100多萬,其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占80%-85%,而肺腺癌是NSCLC的主要病理類型。肺腺癌最顯著的特征是高度浸潤和破壞性生長,它容易侵犯血管和淋巴管壁,進(jìn)而出現(xiàn)血行和淋巴轉(zhuǎn)移。肺癌的發(fā)生發(fā)展是由多條信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié),多因素參與的復(fù)雜過程。如何對(duì)肺腺癌實(shí)施有效的治療提高患者生存,已成為目前研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。我們對(duì)調(diào)控肺腺癌的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路進(jìn)行深入的探索,有助于闡明肺腺癌的發(fā)病機(jī)制,可為其治療找到新的靶點(diǎn)提供思路。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)由ErbB-1/EGFR、Erb B-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-4/HER-4四大成員組成。這些受體酪氨酸激酶家族成員是一類由膜外的配體結(jié)合區(qū)、跨膜區(qū)和膜內(nèi)含有酪氨酸激酶活性的功能結(jié)構(gòu)域組成的跨膜糖蛋白。表皮生長因子受體通過與配體(如EGF)結(jié)合,從而導(dǎo)致胞內(nèi)酪氨酸激酶域活化,形成同源或異源二聚體,引起下游多條在細(xì)胞的分化、增殖、運(yùn)動(dòng)中起重要作用的信號(hào)通路(如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等)的激活。其中EGFR(ErbB-1)是此家族中最重要的成員。其過表達(dá)及活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。據(jù)研究,EGFR是一種與NSCLC進(jìn)展和預(yù)后不良相關(guān)的標(biāo)志性分子,NSCLC中約40%-80%存在EGFR過表達(dá),因此EGFR已成為一個(gè)重要的治療靶點(diǎn),目前針對(duì)EGFR的靶向藥物已應(yīng)用于NSCLC的治療,但其單獨(dú)應(yīng)用的臨床有效率并不高且易產(chǎn)生耐藥,這就提示,EGFR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化可能還受其它多種分子的影響,進(jìn)而在NSCLC的發(fā)生發(fā)展侵襲轉(zhuǎn)移的過程中起重要作用,還需要進(jìn)一步分析研究。小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是小窩蛋白家族中的一員,是細(xì)胞質(zhì)膜表面特異性膜內(nèi)陷囊泡(caveolae)的重要標(biāo)志性結(jié)構(gòu)蛋白,廣泛存在于各種細(xì)胞中,參與多種生命活動(dòng)。Cav-1分子量21-24kDa,共由178個(gè)氨基酸殘基組成,其結(jié)構(gòu)特殊,無胞外區(qū),位于中間的高度保守的疏水性區(qū)域(102-134氨基酸殘基)以發(fā)卡結(jié)構(gòu)鑲嵌在細(xì)胞膜內(nèi),從而將該蛋白鏈分為n末端和c末端兩個(gè)區(qū),其中主要的功能區(qū)域?yàn)閚端的82-101殘基,cav-1不僅主要通過此區(qū)域與膽固醇相互作用,而且還與各種信號(hào)分子(如egfr)結(jié)合,從而調(diào)節(jié)下游信號(hào)通路。近年來cav-1逐漸受到人們的關(guān)注,其參與多種細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及增殖、分化和凋亡,對(duì)腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)和抑制的雙重作用。本研究主要探討cav-1對(duì)肺腺癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其調(diào)控egfr信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的分子機(jī)制,為肺腺癌的治療提供新靶點(diǎn)。首先,體外培養(yǎng)各人肺腺癌細(xì)胞株,觀察其cav-1表達(dá)情況;選取cav-1低表達(dá)的glc-82細(xì)胞株,通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù),上調(diào)cav-1的表達(dá);利用mtt增殖實(shí)驗(yàn)、woundhealing(劃痕修復(fù)實(shí)驗(yàn))和transwell侵襲實(shí)驗(yàn)觀察cav-1對(duì)人肺腺癌glc-82細(xì)胞增殖、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響;經(jīng)westernblot檢測(cè)egfr及其下游通路中各分子的活化水平;體外裸鼠荷瘤實(shí)驗(yàn)觀察cav-1對(duì)glc-82細(xì)胞成瘤能力的影響;收集臨床標(biāo)本,通過免疫組織化學(xué)法探討人肺腺癌組織中cav-1的表達(dá)與臨床病理及預(yù)后的關(guān)系。本研究分以下三個(gè)部分:第一部分cav-1對(duì)肺腺癌glc-82細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機(jī)制探討方法:1westernblot法檢測(cè)不同肺腺癌細(xì)胞中cav-1的表達(dá)情況培養(yǎng)不同肺腺癌細(xì)胞株glc-82、h1975、a549、h1650和h1299,westernblot法檢測(cè)各細(xì)胞株cav-1的表達(dá)水平。2質(zhì)粒轉(zhuǎn)染建立過表達(dá)cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株將含人全長cav-1基因的pcdna3.1質(zhì)粒和空載體質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染低表達(dá)cav-1的人肺腺癌glc-82細(xì)胞,經(jīng)g418抗性篩選,得到過表達(dá)cav-1的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株(glc-82/cav-1)及其對(duì)照組細(xì)胞(glc-82/pcdna3.1);利用實(shí)時(shí)熒光定量pcr和westernblot法檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株中cav-1的mrna和蛋白水平。3mtt比色分析法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖能力將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1細(xì)胞分別接種于96孔板,經(jīng)不同濃度(0nm、4nm、20nm、100nm)的egf刺激,而后加入mtt,測(cè)定各孔吸光度值,檢測(cè)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的增殖能力。4woundhealing實(shí)驗(yàn)檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的遷移能力將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1細(xì)胞分別接種于24孔板,用不含胎牛血清的1640培基饑餓4小時(shí)后,用10μl移液器吸頭進(jìn)行劃痕,并將兩種細(xì)胞各自分別分為無egf刺激組和20nmegf刺激組,顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。5transwell法檢測(cè)轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的侵襲能力將基質(zhì)膠鋪于transwell小室的上室,將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1兩組細(xì)胞分別接種于上室,上室培養(yǎng)液不含胎牛血清,下室培養(yǎng)液含10%胎牛血清,24h后取出小室,95%冰乙醇固定、he染色,顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。6westernblot檢測(cè)egfr活化水平及其下游信號(hào)通路分子的變化將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1細(xì)胞分別接種于培養(yǎng)皿,用不含胎牛血清的1640培基饑餓4h,再20nmegf刺激,于不同時(shí)間點(diǎn)(0min、5min、10min、30min)收集細(xì)胞,提取總蛋白;采用westernblot法檢測(cè)p-egfr及egfr、p-erk及erk的表達(dá)水平。結(jié)果:1不同肺腺癌細(xì)胞株中cav-1的表達(dá)情況利用westernblot檢測(cè)肺腺癌細(xì)胞glc-82、h1975、a549、h1650和h1299中cav-1的表達(dá)水平(0.12±0.00,1.41±0.00,0.64±0.01,1.11±0.01,1.67±0.00),其中g(shù)lc-82細(xì)胞中cav-1的表達(dá)水平是最低的(p0.01)。2穩(wěn)定轉(zhuǎn)染肺腺癌細(xì)胞株中cav-1水平的檢測(cè)glc-82/cav-1細(xì)胞中cav-1mrna的相對(duì)定量值(6.07±0.12)明顯高于glc-82/pcdna3.1細(xì)胞(0.09±0.01),同時(shí)cav-1蛋白的表達(dá)量(0.74±0.05)明顯高于glc-82/pcdna3.1細(xì)胞(0.09±0.01),二者均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。3穩(wěn)定轉(zhuǎn)染cav-1肺腺癌細(xì)胞株的增殖情況經(jīng)不同濃度(0nm、4nm、20nm、100nm)egf刺激后,利用mtt法檢測(cè)各濃度od值glc-82/cav-1組(0.68±0.04,0.79±0.05,0.85±0.03,0.96±0.05)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.56±0.02,0.64±0.03,0.73±0.02,0.82±0.02),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。4穩(wěn)定轉(zhuǎn)染cav-1肺腺癌細(xì)胞株的遷移情況采用woundhealing法檢測(cè)細(xì)胞的遷移能力,首先當(dāng)無egf刺激時(shí),細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的遷移率glc-82/cav-1組(14.01±0.78%,20.70±0.86%,25.23±0.75%,31.96±0.92%,35.07±0.31%)均高于glc-82/pcdna3.1組(7.88±0.81%,14.72±0.97%,18.32±1.50%,23.27±0.27%,26.52±1.39%),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);然后給予20nmegf刺激,細(xì)胞在各時(shí)間點(diǎn)的遷移率glc-82/cav-1組(21.09±1.32%,28.67±0.94%,33.66±0.64%,42.42±1.43%,50.00±0.00%)則明顯高于glc-82/pcdna3.1細(xì)胞(10.01±0.80%,16.08±1.01%,21.77±1.51%,28.42±1.49%,34.68±2.27%),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。5穩(wěn)定轉(zhuǎn)染cav-1肺腺癌細(xì)胞株的侵襲情況采用transwell法檢測(cè)細(xì)胞的侵襲能力,glc-82/cav-1組(71±3)穿膜細(xì)胞數(shù)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(38±3),有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。6穩(wěn)定轉(zhuǎn)染cav-1肺腺癌細(xì)胞株egfr活化水平及其下游信號(hào)通路分子的變化情況采用westernblot檢測(cè)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞經(jīng)egf刺激5min、10min、30min后,cav-1在各時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)量glc-82/cav-1組(0.96±0.67,1.14±0.14,1.25±0.04,0.83±0.09)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.00±0.00,0.00±0.00,0.00±0.00,0.00±0.00),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);p-egfr在各時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)量glc-82/cav-1組(1.11±0.19,1.18±0.24,0.43±0.2)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.71±0.16,0.63±0.21,0.02±0.12),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01);p-erk在各時(shí)間點(diǎn)的蛋白表達(dá)量glc-82/cav-1組(0.15±0.08,0.16±0.04,0.93±0.09)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.14±0.10,0.12±0.04,0.13±0.03),均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。第二部分cav-1對(duì)肺腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)成瘤性的影響及其機(jī)制研究方法:將glc-82/cav-1和glc-82/pcdna3.1細(xì)胞分別接種于5周齡雌性balb/c裸鼠右前肢背部。每組6只裸鼠。調(diào)整細(xì)胞濃度為1×107/ml,即每只1×106個(gè)細(xì)胞。每3天觀察1次,并繪制腫瘤生長曲線、觀察體重變化。8周后處死裸鼠,剝?nèi)×鼋M織后稱重并拍照。一方面,提取瘤組織總蛋白,利用westernblot檢測(cè)不同瘤組織中cav-1和egfr及其下游信號(hào)分子的變化。另一方面,石蠟包埋瘤組織,免疫組織化學(xué)法檢測(cè)cav-1、ki-67和p-egfr的表達(dá)情況。結(jié)果:1裸鼠模型glc-82/cav-1組裸鼠荷瘤體積明顯大于glc-82/pcdna3.1組,且隨時(shí)間的延長差異越大,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。處死裸鼠后,稱取瘤重,glc-82/cav-1組瘤重明顯高于glc-82/pcdna3.1組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。glc-82/cav-1組裸鼠體重稍高于glc-82/pcdna3.1組,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。2免疫組化檢測(cè)瘤組織中蛋白表達(dá)水平利用免疫組化法檢測(cè)瘤組織中蛋白的表達(dá)水平,glc-82/cav-1組cav-1、p-egfr、ki-67的蛋白表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。3westernblot檢測(cè)瘤組織中蛋白表達(dá)水平glc-82/cav-1組cav-1的表達(dá)水平(1.09±0.00,1.51±0.00,1.40±0.00,1.48±0.00)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.02±0.00,0.09±0.00,0.03±0.00,0.03±0.00);p-egfr的表達(dá)水平(0.56±0.02,0.77±0.03,0.46±0.04,0.59±0.01)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.46±0.02,0.33±0.03,0.36±0.01,0.53±0.01);p-erk的表達(dá)水平(1.05±0.02,1.24±0.03,1.52±0.02,0.34±0.02)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.21±0.03,0.37±0.02,0.75±0.02,0.22±0.02),差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)。第三部分cav-1在肺腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征相關(guān)性方法:隨機(jī)選取的68例手術(shù)切除的肺腺癌組織石蠟標(biāo)本,病例資料完整,采用免疫組織化學(xué)第二代聚合酶二步法(pv)檢測(cè)其cav-1、egfr和ki-67的表達(dá)情況。分析研究cav-1在肺腺癌組織中的表達(dá)及其與臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果:1cav-1、egfr和ki-67在肺腺癌組織中的表達(dá)特點(diǎn)cav-1和egfr蛋白在肺腺癌組織中主要分布在細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì),陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,胞核不著色。cav-1蛋白陽性表達(dá)率為51.5%(35/68),egfr蛋白表達(dá)陽性率為52.9%(36/68)。ki-67蛋白在細(xì)胞核表達(dá),陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,陽性表達(dá)率為50%(34/68)。2 Cav-1和Ki-67與肺腺癌臨床病理特征的關(guān)系在68例肺腺癌患者組織中,Cav-1蛋白的高表達(dá)與腫瘤分化程度、有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān),其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但是與年齡、性別和腫瘤大小等無關(guān)。Ki-67蛋白的表達(dá)與有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和臨床分期有關(guān),其差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),但是與年齡、性別、腫瘤大小及分化程度等無關(guān)。3 Cav-1與Ki-67在肺腺癌組織中表達(dá)的相關(guān)性Cav-1和Ki-67表達(dá)共陽性者23例,共陰性者22例,二者的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.324,P0.05)。結(jié)論:1體外實(shí)驗(yàn)表明上調(diào)Cav-1表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞株的增殖、遷移和侵襲能力;2裸鼠成瘤實(shí)驗(yàn)表明上調(diào)Cav-1表達(dá)可促進(jìn)肺腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的成瘤能力;3 Cav-1通過調(diào)控肺腺癌細(xì)胞EGFR的磷酸化,影響Ras-Raf-MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的活化,進(jìn)而影響其一系列生物學(xué)行為;4 Cav-1在人肺腺癌細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)了腫瘤的增殖,浸潤和侵襲。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R734.2

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本文編號(hào)：1466490