本文關鍵詞： 肺腺癌 GLC-82 Cav-1 EGFR 增殖 遷移 侵襲 裸鼠　出處：《河北醫(yī)科大學》2015年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：目的:肺癌是目前世界上發(fā)病率和死亡率最高的惡性腫瘤,已成為癌癥中的第一殺手,嚴重威脅人類生命健康。每年肺癌新發(fā)病例超過100多萬,其中非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)約占80%-85%,而肺腺癌是NSCLC的主要病理類型。肺腺癌最顯著的特征是高度浸潤和破壞性生長,它容易侵犯血管和淋巴管壁,進而出現(xiàn)血行和淋巴轉移。肺癌的發(fā)生發(fā)展是由多條信號轉導通路調節(jié),多因素參與的復雜過程。如何對肺腺癌實施有效的治療提高患者生存,已成為目前研究的重點和難點。我們對調控肺腺癌的信號轉導通路進行深入的探索,有助于闡明肺腺癌的發(fā)病機制,可為其治療找到新的靶點提供思路。表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor,EGFR)由ErbB-1/EGFR、Erb B-2/HER-2、ErbB-3/HER-3和ErbB-4/HER-4四大成員組成。這些受體酪氨酸激酶家族成員是一類由膜外的配體結合區(qū)、跨膜區(qū)和膜內含有酪氨酸激酶活性的功能結構域組成的跨膜糖蛋白。表皮生長因子受體通過與配體(如EGF)結合,從而導致胞內酪氨酸激酶域活化,形成同源或異源二聚體,引起下游多條在細胞的分化、增殖、運動中起重要作用的信號通路(如Ras-Raf-MAPK、PI3K-Akt等)的激活。其中EGFR(ErbB-1)是此家族中最重要的成員。其過表達及活化與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關。據(jù)研究,EGFR是一種與NSCLC進展和預后不良相關的標志性分子,NSCLC中約40%-80%存在EGFR過表達,因此EGFR已成為一個重要的治療靶點,目前針對EGFR的靶向藥物已應用于NSCLC的治療,但其單獨應用的臨床有效率并不高且易產生耐藥,這就提示,EGFR信號轉導通路的活化可能還受其它多種分子的影響,進而在NSCLC的發(fā)生發(fā)展侵襲轉移的過程中起重要作用,還需要進一步分析研究。小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是小窩蛋白家族中的一員,是細胞質膜表面特異性膜內陷囊泡(caveolae)的重要標志性結構蛋白,廣泛存在于各種細胞中,參與多種生命活動。Cav-1分子量21-24kDa,共由178個氨基酸殘基組成,其結構特殊,無胞外區(qū),位于中間的高度保守的疏水性區(qū)域(102-134氨基酸殘基)以發(fā)卡結構鑲嵌在細胞膜內,從而將該蛋白鏈分為n末端和c末端兩個區(qū),其中主要的功能區(qū)域為n端的82-101殘基,cav-1不僅主要通過此區(qū)域與膽固醇相互作用,而且還與各種信號分子(如egfr)結合,從而調節(jié)下游信號通路。近年來cav-1逐漸受到人們的關注,其參與多種細胞的信號轉導及增殖、分化和凋亡,對腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有促進和抑制的雙重作用。本研究主要探討cav-1對肺腺癌細胞生物學行為的影響及其調控egfr信號轉導通路的分子機制,為肺腺癌的治療提供新靶點。首先,體外培養(yǎng)各人肺腺癌細胞株,觀察其cav-1表達情況;選取cav-1低表達的glc-82細胞株,通過質粒轉染技術,上調cav-1的表達;利用mtt增殖實驗、woundhealing(劃痕修復實驗)和transwell侵襲實驗觀察cav-1對人肺腺癌glc-82細胞增殖、遷移和侵襲等生物學行為的影響;經(jīng)westernblot檢測egfr及其下游通路中各分子的活化水平;體外裸鼠荷瘤實驗觀察cav-1對glc-82細胞成瘤能力的影響;收集臨床標本,通過免疫組織化學法探討人肺腺癌組織中cav-1的表達與臨床病理及預后的關系。本研究分以下三個部分:第一部分cav-1對肺腺癌glc-82細胞生物學行為的影響及機制探討方法:1westernblot法檢測不同肺腺癌細胞中cav-1的表達情況培養(yǎng)不同肺腺癌細胞株glc-82、h1975、a549、h1650和h1299,westernblot法檢測各細胞株cav-1的表達水平。2質粒轉染建立過表達cav-1的穩(wěn)定轉染細胞株將含人全長cav-1基因的pcdna3.1質粒和空載體質粒分別轉染低表達cav-1的人肺腺癌glc-82細胞,經(jīng)g418抗性篩選,得到過表達cav-1的穩(wěn)定轉染細胞株(glc-82/cav-1)及其對照組細胞(glc-82/pcdna3.1);利用實時熒光定量pcr和westernblot法檢測穩(wěn)轉細胞株中cav-1的mrna和蛋白水平。3mtt比色分析法檢測轉染細胞株的增殖能力將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1細胞分別接種于96孔板,經(jīng)不同濃度(0nm、4nm、20nm、100nm)的egf刺激,而后加入mtt,測定各孔吸光度值,檢測穩(wěn)定轉染細胞株的增殖能力。4woundhealing實驗檢測轉染細胞株的遷移能力將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1細胞分別接種于24孔板,用不含胎牛血清的1640培基饑餓4小時后,用10μl移液器吸頭進行劃痕,并將兩種細胞各自分別分為無egf刺激組和20nmegf刺激組,顯微鏡下觀察劃痕愈合情況。5transwell法檢測轉染細胞株的侵襲能力將基質膠鋪于transwell小室的上室,將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1兩組細胞分別接種于上室,上室培養(yǎng)液不含胎牛血清,下室培養(yǎng)液含10%胎牛血清,24h后取出小室,95%冰乙醇固定、he染色,顯微鏡下計數(shù)穿膜細胞數(shù)。6westernblot檢測egfr活化水平及其下游信號通路分子的變化將glc-82/pcdna3.1及glc-82/cav-1細胞分別接種于培養(yǎng)皿,用不含胎牛血清的1640培基饑餓4h,再20nmegf刺激,于不同時間點(0min、5min、10min、30min)收集細胞,提取總蛋白;采用westernblot法檢測p-egfr及egfr、p-erk及erk的表達水平。結果:1不同肺腺癌細胞株中cav-1的表達情況利用westernblot檢測肺腺癌細胞glc-82、h1975、a549、h1650和h1299中cav-1的表達水平(0.12±0.00,1.41±0.00,0.64±0.01,1.11±0.01,1.67±0.00),其中glc-82細胞中cav-1的表達水平是最低的(p0.01)。2穩(wěn)定轉染肺腺癌細胞株中cav-1水平的檢測glc-82/cav-1細胞中cav-1mrna的相對定量值(6.07±0.12)明顯高于glc-82/pcdna3.1細胞(0.09±0.01),同時cav-1蛋白的表達量(0.74±0.05)明顯高于glc-82/pcdna3.1細胞(0.09±0.01),二者均有統(tǒng)計學意義(p0.01)。3穩(wěn)定轉染cav-1肺腺癌細胞株的增殖情況經(jīng)不同濃度(0nm、4nm、20nm、100nm)egf刺激后,利用mtt法檢測各濃度od值glc-82/cav-1組(0.68±0.04,0.79±0.05,0.85±0.03,0.96±0.05)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.56±0.02,0.64±0.03,0.73±0.02,0.82±0.02),均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。4穩(wěn)定轉染cav-1肺腺癌細胞株的遷移情況采用woundhealing法檢測細胞的遷移能力,首先當無egf刺激時,細胞在各時間點的遷移率glc-82/cav-1組(14.01±0.78%,20.70±0.86%,25.23±0.75%,31.96±0.92%,35.07±0.31%)均高于glc-82/pcdna3.1組(7.88±0.81%,14.72±0.97%,18.32±1.50%,23.27±0.27%,26.52±1.39%),均有統(tǒng)計學意義(p0.05);然后給予20nmegf刺激,細胞在各時間點的遷移率glc-82/cav-1組(21.09±1.32%,28.67±0.94%,33.66±0.64%,42.42±1.43%,50.00±0.00%)則明顯高于glc-82/pcdna3.1細胞(10.01±0.80%,16.08±1.01%,21.77±1.51%,28.42±1.49%,34.68±2.27%),均有統(tǒng)計學意義(p0.05)。5穩(wěn)定轉染cav-1肺腺癌細胞株的侵襲情況采用transwell法檢測細胞的侵襲能力,glc-82/cav-1組(71±3)穿膜細胞數(shù)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(38±3),有統(tǒng)計學意義(p0.01)。6穩(wěn)定轉染cav-1肺腺癌細胞株egfr活化水平及其下游信號通路分子的變化情況采用westernblot檢測穩(wěn)轉細胞經(jīng)egf刺激5min、10min、30min后,cav-1在各時間點的蛋白表達量glc-82/cav-1組(0.96±0.67,1.14±0.14,1.25±0.04,0.83±0.09)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.00±0.00,0.00±0.00,0.00±0.00,0.00±0.00),均有統(tǒng)計學意義(p0.01);p-egfr在各時間點的蛋白表達量glc-82/cav-1組(1.11±0.19,1.18±0.24,0.43±0.2)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.71±0.16,0.63±0.21,0.02±0.12),均有統(tǒng)計學意義(p0.01);p-erk在各時間點的蛋白表達量glc-82/cav-1組(0.15±0.08,0.16±0.04,0.93±0.09)均明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.14±0.10,0.12±0.04,0.13±0.03),均有統(tǒng)計學意義(p0.01)。第二部分cav-1對肺腺癌細胞在裸鼠體內成瘤性的影響及其機制研究方法:將glc-82/cav-1和glc-82/pcdna3.1細胞分別接種于5周齡雌性balb/c裸鼠右前肢背部。每組6只裸鼠。調整細胞濃度為1×107/ml,即每只1×106個細胞。每3天觀察1次,并繪制腫瘤生長曲線、觀察體重變化。8周后處死裸鼠,剝取瘤組織后稱重并拍照。一方面,提取瘤組織總蛋白,利用westernblot檢測不同瘤組織中cav-1和egfr及其下游信號分子的變化。另一方面,石蠟包埋瘤組織,免疫組織化學法檢測cav-1、ki-67和p-egfr的表達情況。結果:1裸鼠模型glc-82/cav-1組裸鼠荷瘤體積明顯大于glc-82/pcdna3.1組,且隨時間的延長差異越大,有統(tǒng)計學意義(p0.01)。處死裸鼠后,稱取瘤重,glc-82/cav-1組瘤重明顯高于glc-82/pcdna3.1組,有統(tǒng)計學意義(p0.01)。glc-82/cav-1組裸鼠體重稍高于glc-82/pcdna3.1組,但無統(tǒng)計學意義(p0.05)。2免疫組化檢測瘤組織中蛋白表達水平利用免疫組化法檢測瘤組織中蛋白的表達水平,glc-82/cav-1組cav-1、p-egfr、ki-67的蛋白表達水平明顯高于對照組,有統(tǒng)計學意義(p0.01)。3westernblot檢測瘤組織中蛋白表達水平glc-82/cav-1組cav-1的表達水平(1.09±0.00,1.51±0.00,1.40±0.00,1.48±0.00)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.02±0.00,0.09±0.00,0.03±0.00,0.03±0.00);p-egfr的表達水平(0.56±0.02,0.77±0.03,0.46±0.04,0.59±0.01)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.46±0.02,0.33±0.03,0.36±0.01,0.53±0.01);p-erk的表達水平(1.05±0.02,1.24±0.03,1.52±0.02,0.34±0.02)明顯高于glc-82/pcdna3.1組(0.21±0.03,0.37±0.02,0.75±0.02,0.22±0.02),差異均有統(tǒng)計學意義(p0.01)。第三部分cav-1在肺腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征相關性方法:隨機選取的68例手術切除的肺腺癌組織石蠟標本,病例資料完整,采用免疫組織化學第二代聚合酶二步法(pv)檢測其cav-1、egfr和ki-67的表達情況。分析研究cav-1在肺腺癌組織中的表達及其與臨床病理特征的相關性。結果:1cav-1、egfr和ki-67在肺腺癌組織中的表達特點cav-1和egfr蛋白在肺腺癌組織中主要分布在細胞膜和細胞質,陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,胞核不著色。cav-1蛋白陽性表達率為51.5%(35/68),egfr蛋白表達陽性率為52.9%(36/68)。ki-67蛋白在細胞核表達,陽性呈棕黃色或棕褐色顆粒狀,陽性表達率為50%(34/68)。2 Cav-1和Ki-67與肺腺癌臨床病理特征的關系在68例肺腺癌患者組織中,Cav-1蛋白的高表達與腫瘤分化程度、有無淋巴結轉移和臨床分期有關,其差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),但是與年齡、性別和腫瘤大小等無關。Ki-67蛋白的表達與有無淋巴結轉移和臨床分期有關,其差異均有統(tǒng)計學意義(P0.05),但是與年齡、性別、腫瘤大小及分化程度等無關。3 Cav-1與Ki-67在肺腺癌組織中表達的相關性Cav-1和Ki-67表達共陽性者23例,共陰性者22例,二者的表達呈正相關(r=0.324,P0.05)。結論:1體外實驗表明上調Cav-1表達可促進肺腺癌細胞株的增殖、遷移和侵襲能力;2裸鼠成瘤實驗表明上調Cav-1表達可促進肺腺癌細胞在裸鼠體內的成瘤能力;3 Cav-1通過調控肺腺癌細胞EGFR的磷酸化,影響Ras-Raf-MAPK信號轉導通路的活化,進而影響其一系列生物學行為;4 Cav-1在人肺腺癌細胞中的表達促進了腫瘤的增殖,浸潤和侵襲。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R734.2

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本文編號：1466490