本文關鍵詞： 周圍性肺癌 超聲檢測 CDFI HIF-1α MMP9 血管新生 鎘 VEGF 肺腺癌 內皮細胞 血管生成　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：近半個世紀以來,在中國乃至世界范圍內,肺癌的發(fā)病率及死亡率一直在不斷攀升。肺癌最常見的幾個組織類型包括非小細胞肺癌和小細胞肺癌,前者又可分為大細胞癌,鱗狀細胞癌以及腺癌。近年來,由于低焦油含量型煙草產品的出現,肺腺癌的發(fā)病率已經超過鱗狀細胞癌,成為肺癌的主要類型。而女性對肺腺癌的易感性較前也有所增加。早期診斷是有效降低肺腺癌死亡率的重要手段。因肺腺癌早期常無明顯容易發(fā)現的特征性臨床癥狀,故早期確診困難很大。腫瘤早期發(fā)生淋巴結及遠處器官轉移是影響肺腺癌總體預后的重要原因之一。大部分肺腺癌患者在得到確診時已處于疾病的晚期階段,甚至已經伴有區(qū)域淋巴結轉移和遠處轉移。雖然隨著分子生物學技術和臨床診治水平的高速度發(fā)展,我們對肺腺癌的分子生物學機制的認識有了一些進步,但我們對于其發(fā)病詳細機制仍然認識不足,目前缺乏行之有效的可以早期確診肺腺癌以及判斷其預后的方法。故需要進行更多的研究,來闡明相關的發(fā)病分子機制,以期找到更合適的早期診斷、治療以及預防肺腺癌轉移的有效方法,來延長患者的生存期限,提高患者生活質量。惡性腫瘤的生物學特性就是無限制的生長。這種不受任何限制的增生一方面會奪取掉大量正常組織生長需要的營養(yǎng)物質,從而導致機體感覺體乏無力,出現身體逐漸消瘦甚至出現惡病質的現象；另一方面腫瘤細胞的增生還會產生大量的毒素,可以引起機體產生各種不適癥狀,例如持續(xù)低熱等。惡性腫瘤可以通過直接轉移、血液途徑轉移以及淋巴管路途徑等轉移到周圍臨近組織器官或者遠處器官形成新的轉移灶,故惡性腫瘤的預后較差。因為新生血管可為腫瘤組織提供生長所必須的充足的氧氣和營養(yǎng)物質,腫瘤細胞的增殖、對周圍臨近組織的浸潤以及遠處轉移均是以血管生成為基礎的。HIF-1α為特異性低氧狀態(tài)下具有活性的轉錄因子,其表達較為廣泛,在多種惡性腫瘤中都參與腫瘤血管的新生活動。細胞外基質具有阻止細胞自由移動的的作用,如果被降解則失去阻止細胞移動的功能,從而有利于腫瘤細胞發(fā)生轉移。基質金屬蛋白酶可以降解掉細胞外基質的多種膠原。正常情況下,細胞外基質的膠原可以防止腫瘤細胞入侵,無論是阻止腫瘤細胞侵襲還是防止腫瘤細胞發(fā)生遠處轉移,細胞外基質均發(fā)揮重要作用。一旦細胞外基質被酶水解,其防御功能減弱,更有利于腫瘤的侵襲和轉移。金屬蛋白酶-9是基質金屬蛋白酶的一種,在腫瘤生長和侵襲過程中發(fā)揮重要作用。已有文獻報道,金屬蛋白酶-9表達的水平與非小細胞肺癌的預后有相關性。臨床上大家較認可的腫瘤新生血管評價方法是免疫組化染色后測定腫瘤組織的微血管密度,從而可以評價腫瘤新生血管的有關信息。準確度高,但是因其為有創(chuàng)性操作,患者常不愿接受該檢查。而且因為有創(chuàng),該檢查對于持續(xù)評價腫瘤血管治療后的情況變化可操作性欠佳。因此,隨著影像學檢查技術的迅速發(fā)展,CT、MRI、超聲等在腫瘤血管評價方面都做了相應的嘗試。既往認為,因受肺內氣體的強反射和肩胛骨及肋骨的干擾,超聲在肺部的應用受到很大限制。但近年來,隨著超聲儀器的更新?lián)Q代以及技術的不斷進步,超聲在胸壁、肺周邊部病變,肺水腫等疾病中的應用逐漸增多。超聲對于肺癌,主要是鄰近胸壁的周圍型肺癌、肺上溝肺癌,鄰近膈肌的肺底部癌及合并阻塞性肺炎或肺不張的某些深部肺癌的診斷有其獨特的價值。超聲多普勒具有無創(chuàng)、可重復性強、可實時監(jiān)測組織血流變化等特點,故可以結合CDFI檢測腫瘤組織血供情況,從而為評價腫瘤組織血管新生程度提供新的無創(chuàng)檢測方法。本研究第一部分旨在通過檢測肺腫瘤組織中MMP9、HIF-la的表達情況,結合超聲顯示腫塊血供情況,討論超聲血流分級情況在評價周圍性肺腺癌血管生成程度中的應用,為周圍型肺腺癌的無創(chuàng)診斷以及對肺癌治療效果的預判提供理論依據。綜合目前醫(yī)學研究的各種學說,目前學術界大多認為惡性腫瘤的發(fā)生是多種因素長期相互作用相互影響的結果。籠統(tǒng)的說,導致惡性腫瘤發(fā)生的多種因素包括內因和外因。基因遺傳和基因突變等遺傳因素、內分泌因素以及免疫因素均屬于機體內在因素,化學因素、物理因素、生物因素等均屬于外在環(huán)境因素。現在隨著我國經濟建設的日新月異,大多數化學污染物及重金屬等污染物會隨著農藥的應用、化工廢料的排放、金屬冶煉后廢舊殘渣的傾倒等各種工業(yè)活動進入我們的生活環(huán)境中,環(huán)境污染已經成為引起惡性腫瘤發(fā)生的重要因素。已經有多個報道,我國某些地市因生活環(huán)境被某些化學產品或者某種重金屬污染,從而造成該地區(qū)生活群眾惡性腫瘤集中發(fā)生的現象,甚至出現了“癌癥村”。環(huán)境污染作為惡性腫瘤的誘因已不容忽視。有研究發(fā)現,在腫瘤發(fā)生過程中,重金屬污染物起到較重要的作用。一方面,重金屬污染物被吸收入機體后可以誘導其基因發(fā)生突變,從而有進一步發(fā)生惡性腫瘤的可能,另一方面,已經發(fā)生基因突變的機體,對于其所處周圍環(huán)境中的重金屬污染物的刺激更加敏感。當兩者同時存在于同一機體時,該機體發(fā)生腫瘤的可能性會大大增加。有統(tǒng)計資料顯示,約3/4的腫瘤是由于重金屬污染引起的。例如,已明確發(fā)現,砷可以引起包括肺癌、皮膚癌在內的多種惡性腫瘤的發(fā)生。目前人類生活環(huán)境中鎘污染主要來源于現代工業(yè)生產。重金屬鎘目前已被大量應用到油漆、電鍍等行業(yè)中。鎘對人體健康的危害非常之嚴重。重金屬鎘已經被美國毒物管理委員會列為嚴重危害人體健康的毒物之一。早在1993年時,鎘即被國際腫瘤研究機構劃分為致癌物質。鎘在機體內的生物半衰期很長,可達10～30年,所以,鎘在機體內很容易被蓄積。飲食、吸煙以及相關職業(yè)暴露是人類長期慢性接觸微量鎘污染的主要來源。長期低劑量接觸鎘對人體可能還有很多嚴重的目前尚未知的危害。雖然鎘暴露與一些器官發(fā)生腫瘤的關系尚不清楚,但是已經證實,鎘在人體內可引起肺癌的發(fā)生。在細胞實驗以及嚙齒類動物實驗中已經有許多關于鎘引起腫瘤的機制研究,且有些實驗發(fā)現,在嚙齒類動物中,鎘與肺腺癌的發(fā)生有劑量依賴關系。但鎘是如何促進肺腺癌發(fā)生及發(fā)展的,其具體機制尚不明確。血管新生指的是在已存在的血管上生成新的血管的過程。機體內密布的血管網絡為機體組織提供可以交換的氧氣和所需的營養(yǎng)物質,同時排出代謝產物。對腫瘤的增殖及轉移等實體腫瘤的生長過程同樣有著非常重要的作用。據報道,在含氧量偏低的環(huán)境中,腫瘤細胞可以在其局部分泌血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(bFGF)等多種促進血管生成因子。血管內皮細胞上分布有多種生長因子受體的表達,例如VEGF受體2,FGF受體1等。這些受體與其相應生長因子結合后,一系列調節(jié)因子被激活而發(fā)揮作用,使得血管內皮細胞增生能力及遷移能力增強。據研究證實,鎘對血管內皮有毒性作用。但迄今為止,鎘對于腫瘤血管生長的作用仍存有爭議。有研究表明,在一定的濃度范圍內,鎘可以增加VEGFR2活性并促進內皮組織血管形成。然而,也有研究表明,鎘可以損傷人乳腺癌細胞誘導血管新生的能力。故鎘對肺腺癌中血管生成是否有影響目前尚未明確。為闡明鎘在肺腺癌血管新生中的作用及其機制,我們觀察鎘對人肺腺癌細胞中血管內皮生長因子(VEGF)、成纖維細胞生長因子(b-FGF)表達及分泌的影響,觀察鎘處理的A549腫瘤條件培養(yǎng)液與HUVECs共培養(yǎng)時對HUVECs增殖、遷移及凋亡的影響；觀察鎘直接作用于A549細胞的增殖、遷移及凋亡的影響,以期發(fā)現鎘在肺腺癌血管新生、惡性腫瘤生成、侵襲及轉移中的作用及作用機制。第一部分：超聲檢測肺腺癌血流分級與血管生成的相關性研究研究目的：應用多普勒超聲評價周圍性肺腺癌的血供情況,通過檢測腫瘤組織血管分布密度特點,反應腫瘤血供程度。同時檢測肺腺癌組織中缺氧誘導因子-1a(HIF-1α)、MMP9在腫瘤組織中表達水平,比較周圍型肺腺癌血管生成因子與其相應多普勒超聲評價血流分級之間的關系。研究方法：對66例經術后病理診斷為肺腺癌的周圍性肺癌病人術前進行常規(guī)二維超聲和CDFI檢查,根據CDFI所示血供豐富程度共分為O～Ⅲ4個等級,其中O-Ⅰ級為乏血供組,Ⅱ～Ⅲ級為富血供組。將患者手術切除的腫瘤組織,運用免疫組化方法檢測HIF-1α、MMP9在肺癌組織中的表達情況。結果：66例肺腺癌患者,CDFI示血流分級為0級肺腺癌患者16例,其中6例HIF-1α表達陽性,陽性率為37.5%,5例MMP9表達陽性,陽性率為31.2%。CDFI示血流分級為Ⅰ級肺腺癌患者共11例,其中6例HIF-1α表達陽性,陽性率為54.5%,5例MMP9表達陽性,陽性率為45.4%。CDFI示血流分級為Ⅱ級肺腺癌患者共23例,其中16例HIF-1α表達陽性,陽性率為69.5%,15例MMP9表達陽性,陽性率為65.2%。CDFI示血流分級為Ⅲ級肺腺癌患者共16例,其中12例HIF-1α表達陽性,陽性率為75%,13例MMP9表達陽性,陽性率為81.2%。肺腺癌病灶內超聲血流分級與HIF-1α及MMP9的表達呈正相關(P0.05)。結論：超聲探及周圍性肺腺癌的血供分級水平能反應相應病灶內血管新生程度,對臨床選擇肺癌的診治方案有一定意義。第二部分：低濃度鎘致肺腺癌血管新生機制的研究研究目的：通過檢測一系列低濃度鎘對肺腺癌A549細胞VEGF和b-FGF表達和分泌的影響,進一步收集鎘處理的A549肺腺癌細胞條件培養(yǎng)液,觀察條件培養(yǎng)液對HUVECs細胞的影響。探討在體外實驗中,鎘對肺腺癌腫瘤細胞血管新生的影響及其可能的作用機制。研究內容、方法：1.Cd對人肺腺癌A549細胞VEGF及b-FGF的影響。使用不同濃度的CdCl2 (0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, and 10μM)處理人肺腺癌A549細胞,觀察A549細胞生長情況,用實時熒光定量PCR法檢測不同濃度鎘處理后A549細胞中VEGF及b-FGF mRNA的表達水平。用免疫印跡法(Western blotting)檢測鎘處理后A549細胞VEGF蛋白表達的變化,ELISA法檢測鎘處理后A549細胞VEGF及b-FGF的分泌。分析鎘對肺腺癌A549細胞VEGF及b-FGF的影響。2.Cd處理的A549細胞條件培養(yǎng)液對HUVECs細胞增殖和遷移的影響。制作A549細胞條件培養(yǎng)液。使用A549細胞條件培養(yǎng)液處理HUVECs細胞,采用MTT法檢測Cd處理的A549條件培養(yǎng)液對HUVEC細胞增殖的影響。用ECIS法檢測HUVECs細胞損傷后修復(遷移)情況。使用流式細胞儀檢測HUVECs細胞的凋亡率。3.Cd對人肺腺癌A549細胞HIF-1α蛋白表達的影響。使用1μM CdCl2處理A549人肺腺癌細胞株,使用免疫印跡法(Western blotting)檢測A549細胞HIF-la蛋白的表達。4.Cd對人肺腺癌A549細胞增殖、遷移及凋亡的影響。使用不同濃度的CdCl2 (0.1μM,0.5μM, 1μM,5μM, and 10μM)處理人肺腺癌細胞A549,用MTT檢測鎘對A549細胞增殖、遷移及凋亡的影響。結果：1.低濃度Cd(0.5μM,1μM)可以促進人肺腺癌A549細胞VEGF mRNA的表達,Cd對人肺腺癌A549細胞b-FGF mRNA的表達無明顯影響。人肺腺癌A549細胞經0.5μM、1μM Cd處理后,VEGF mRNA水平明顯增加,有統(tǒng)計學意義(0.5μM:1.52±0.17,P0.05:1μM:2.5±0.39,P 0.01).人肺腺癌A549細胞經0.1μM、5μM、10μM Cd處理后,VEGF mRNA水平無明顯變化(0.1μM:1.07±0.04,P=O005:5μM:1.53±0.51,P=0.154; 10μM:1.11±0.23,P=0.468).人肺腺癌A549細胞經不同濃度Cd處理后,b-FGF mRNA水平均無明顯變化。2.低濃度Cd(1μM)促進人肺腺癌A549細胞VEGF蛋白的合成和分泌,對b-FGF蛋白分泌無明顯影響。人肺腺癌A549細胞經1μM Cd處理后,細胞內VEGF蛋白水平明顯增加(Control:1.11±0.13:Cd:1.79±0.17,P0.05),培養(yǎng)基中VEGF水平明顯增加(1.58±0.11,P0.01),b-FGF無明顯變化(1.05±0.14,P=0.74)。3.鎘處理后的肺腺癌A549細胞條件培養(yǎng)液可促進HUVECs細胞增殖和遷移。與對照組相比,經Cd-A549條件培養(yǎng)液后,MTT顯示HUVECs細胞增殖明顯增加(1.25±0.06,P0.01),ECIS示跨細胞電阻明顯增加(1.64±0.19,P0.05),也證明HUVECs細胞的遷移明顯增加。流式細胞儀檢測結果示細胞凋亡無明顯變化。4.低濃度Cd促進人肺腺癌A549細胞HIF-1p的蛋白合成。人肺腺癌A549細胞經1μMM Cd處理后,細胞內HIF-1α蛋白水平明顯增加,有統(tǒng)計學意義。5.Cd對人肺癌腺癌細胞A549細胞的增殖能力、遷移能力及凋亡均無明顯影響。人肺腺癌A549細胞經一系列濃度Cd(0.1μMM,0.5μM,1μM,5μM,and 10μM)處理后,MTT檢測發(fā)現A549細胞增殖能力無明顯變化,劃痕實驗檢測發(fā)現A549細胞遷移能力無明顯變化,流式細胞儀檢測結果顯示A549細胞凋亡無明顯變化。結論：1.低濃度鎘刺激人肺腺癌A549細胞,使A549細胞VEGF表達和分泌增加,從而促進血管內皮細胞的增殖和遷移,發(fā)揮其促進腫瘤血管新生的作用。2.低濃度鎘可能通過增加HIF-1α的合成促進VEGF的分泌。3.低濃度鎘對肺腺癌細胞本身的生長和增殖沒有明顯的作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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