本文關鍵詞：核受體共激活因子NCOA5單克隆抗體的制備及其在乳腺癌中的表達研究　出處：《蘇州大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：目的:應用小鼠雜交瘤技術制備能夠識別NCOA5蛋白的單克隆抗體;檢測乳腺癌標本中NCOA5的表達,并分析NCOA5與相關臨床病理指標的相關性;觀察沉默NCOA5對于乳腺癌細胞增殖、遷移的影響。方法:利用PCR技術體外擴增NCOA5羧基C端基因片段,將該片段插入原核表達載體pET-41a中;使用IPTG誘導NCOA5重組蛋白的表達;采用SDS-PAGE分析表達產(chǎn)物的可溶性并進行規(guī)�；磉_,采用Ni-NTA柱親和純化NCOA5重組蛋白,采用紫外分光光度計、SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍染色分析蛋白濃度和純度;利用小鼠雜交瘤技術制備抗NCOA5的單克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA)、蛋白質免疫印跡(Western Blot)、免疫熒光(Immunoflousece)和免疫組化(Immunohistochemistry)方法驗證單克隆抗體識別NCOA5的敏感性及特異性;利用PCR技術分段擴增NCOA5 C端基因片段,將其插入pMAL-c2X原核表達載體并進行原核蛋白的表達,通過Western Blot初步分析單克隆抗體所識別表位氨基酸序列;利用所制備的單抗行免疫組化檢測NCOA5在乳腺癌標本中的表達,統(tǒng)計其與相關臨床病理指標的關系;應用慢病毒技術干擾NCOA5在乳腺癌細胞系MDA-MB-231中的表達,細胞增殖實驗(CCK-8 assay)檢測其對細胞增殖的影響,細胞劃痕(wound healing)及Transwell實驗檢測其對細胞遷移的影響。結果:成功構建了pET-41a/NCOA5-C-ter重組質粒用于原核蛋白的表達,考馬斯亮藍染色顯示誘導細菌裂解后上清蛋白大小約69 kDa,與預期一致,說明成功表達NCOA5重組蛋白,純化后考馬斯亮藍染色顯示蛋白純度高、可用于免疫小鼠;雜交瘤細胞經(jīng)間接ELISA檢測成功篩選出一株抗體8B11,抗體效價為1:32,000。Western Blot、免疫熒光及免疫組化方法提示單克隆抗體8B11能夠特異性識別細胞內NCOA5,NCOA5定位于細胞核并在多個腫瘤細胞系中存在表達;正確構建了pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-N’及pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-C’重組質粒用于分段表達NCOA5 C端原核蛋白,考馬斯亮藍染色顯示誘導細菌裂解后上清蛋白大小與預期一致,說明重組蛋白表達成功,Western Blot顯示8B11能夠識別NCOA5蛋白第291-434個氨基酸組成的蛋白;乳腺癌標本的免疫組化結果顯示,隨著腫瘤的增大,NCOA5表達的陽性表達率升高(P=0.008);在有淋巴結轉移組中,NCOA5表達的陽性表達率升高(P=0.042);隨著腫瘤TNM分期的增加,NCOA5的陽性表達率逐漸上升(P=0.028);NCOA5在ER陰性標本中陽性表達率顯著升高(P=0.006);NCOA5在PR陰性標本中陽性表達率升高(P=0.025);NCOA5表達與年齡、組織學分級、HER-2無明顯統(tǒng)計學意義(P0.05)。慢病毒感染乳腺癌細胞株MDA-MB-231后,Western Blot顯示沉默NCOA5表達有效,CCK-8法表明沉默NCOA5后細胞增殖能力下降(P0.05),細胞劃痕(wound healing)及Transwell實驗表明沉默NCOA5后細胞遷移能力下降(P0.01)。結論:(1)利用pET-41a原核表達載體,成功表達并純化了NCOA5 C端重組蛋白;(2)利用雜交瘤技術成功制備了一株效價高、特異性好單克隆抗體8B11,可用于Western Blot、免疫熒光和免疫組化檢測NCOA5的表達情況,其抗原表位范圍為NCOA5蛋白第384-434個氨基酸;(3)NCOA5在肝癌、乳腺癌、結腸癌、胰腺癌細胞系中均存在表達,NCOA5在乳腺癌中陽性表達與腫瘤大小、淋巴結轉移、TNM分期及ER、PR的表達水平相關,具有作為腫瘤標志物的潛在價值;(4)沉默乳腺癌細胞MDA-MB-231中NCOA5的表達導致細胞增殖及遷移能力下降,提示NCOA5能夠通過ERα以外的途徑影響細胞的增殖和遷移能力,為進一步探討NCOA5參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體機制提供基礎。
[Abstract]:Objective: the application of mouse hybridoma technology for preparation of monoclonal antibodies to NCOA5 protein; the expression of NCOA5 in breast cancer tissues, and to analyze the correlation between NCOA5 and clinical pathological indicators; observe the silencing of NCOA5 for breast cancer cell proliferation, migration effect. Methods: using in vitro PCR amplification NCOA5 carboxyl end gene fragment of C. The fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET-41a; inducible expression of recombinant NCOA5 protein using IPTG; SDS-PAGE was used to analyze the expression of soluble and scale expression, using Ni-NTA affinity purified recombinant NCOA5 protein, using UV spectrophotometer, analysis of protein concentration and purity of SDS-PAGE electrophoresis and Coomassie blue staining; monoclonal the anti NCOA5 antibody in mice using hybridoma technique, by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting, immunofluorescence (Western Blot) (Immuno Flousece) and immunohistochemistry (Immunohistochemistry) method to verify the sensitivity and specificity of NCOA5 monoclonal antibodies; C gene fragment amplified NCOA5 terminal using PCR technology, the expression of inserted into prokaryotic expression vector pMAL-c2X and prokaryotic protein by Western Blot, a preliminary analysis of monoclonal antibody epitopes using the amino acid sequence; preparation of monoclonal antibodies for immunohistochemical detection of NCOA5 expression in breast cancer specimens, the relationship between statistics and related clinical pathological factors; expression of lentiviral NCOA5 interference technology in breast cancer cell line MDA-MB-231, cell proliferation assay (CCK-8 assay) to detect its effect on cell proliferation, cell scratch (wound healing) and Transwell test to detect its effect on cell migration. Results: successfully constructed pET-41a/NCOA5-C-ter recombinant plasmid for prokaryotic expression, Coomassie brilliant blue Staining induced bacterial lysis after the supernatant protein size is about 69 kDa, consistent with expectations, indicating the successful expression of NCOA5 recombinant protein, purified by Coomassie brilliant blue staining showed that the protein of high purity, can be used for immunization of mice; hybridoma cells were screened by indirect ELISA detection of a 8B11 antibody, the antibody titer was 1:32000.Western Blot, immunofluorescence immunohistochemistry and prompt 8B11 monoclonal antibody could specifically recognize NCOA5 cells, NCOA5 localized in the nucleus and in the presence of multiple tumor cell lines expression; the correct construction of the recombinant plasmid pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-C pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-N 'and' NCOA5 C end for segmented expression of prokaryotic protein, Kaumas shows Coomassie brilliant blue staining is consistent with the expected size of the supernatant protein induced by bacteria after cracking, that the recombinant protein was successfully expressed, Western Blot shows that 8B11 can recognize NCOA5 protein 291-434 amino Acid protein; immunohistochemical results of breast cancer were showed as the tumor increased, the expression of NCOA5 positive expression rate increased (P=0.008); in the group with lymph node metastasis, the expression of NCOA5 positive expression rate increased (P=0.042); with the increase of TNM staging, the positive expression rate of NCOA5 increased gradually (P=0.028); NCOA5 in ER negative samples positive expression rate was significantly increased (P=0.006); NCOA5 in PR negative samples positive expression rate increased (P=0.025); the expression of NCOA5 with age, histological grade, HER-2 had no statistical significance (P0.05). The lentiviral infection of breast cancer cell line MDA-MB-231, Western Blot silence the expression of NCOA5, CCK-8 showed a decrease in cell proliferation ability after silencing NCOA5 (P0.05), cell scratch (wound healing) and Transwell experiments showed that the decreased cell migration ability after silencing NCOA5 (P0.01). Conclusion: (1) using pET-41a prokaryotic expression As the carrier, NCOA5 C successfully expressed and purified the recombinant protein; (2) by hybridoma technique was successfully prepared a high titer and specificity of 8B11 monoclonal antibody can be used for Western Blot expression by immunofluorescence and immunohistochemical detection of NCOA5, the epitope of NCOA5 protein in the range of 384-434 amino acid; (3) NCOA5 in hepatocellular carcinoma, breast cancer, colon cancer, expressed in pancreatic cancer cell lines, NCOA5 in breast cancer expression and tumor size, lymph node metastasis, TNM staging and ER, related to the expression level of PR, which has potential value as a tumor marker; (4 the silence of NCOA5 expression in breast cancer cells) in MDA-MB-231 resulted in decreased proliferation and migration of cells, suggesting that NCOA5 can approach by ER alpha outside affect the ability of cell proliferation and migration, to further explore the NCOA5 specific mechanisms involved in breast cancer development process Basics.

【學位授予單位】：蘇州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R737.9

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本文編號：1432049