本文關(guān)鍵詞：核受體共激活因子NCOA5單克隆抗體的制備及其在乳腺癌中的表達(dá)研究　出處：《蘇州大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:應(yīng)用小鼠雜交瘤技術(shù)制備能夠識(shí)別NCOA5蛋白的單克隆抗體;檢測(cè)乳腺癌標(biāo)本中NCOA5的表達(dá),并分析NCOA5與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的相關(guān)性;觀察沉默NCOA5對(duì)于乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移的影響。方法:利用PCR技術(shù)體外擴(kuò)增NCOA5羧基C端基因片段,將該片段插入原核表達(dá)載體pET-41a中;使用IPTG誘導(dǎo)NCOA5重組蛋白的表達(dá);采用SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物的可溶性并進(jìn)行規(guī)模化表達(dá),采用Ni-NTA柱親和純化NCOA5重組蛋白,采用紫外分光光度計(jì)、SDS-PAGE電泳及考馬斯亮藍(lán)染色分析蛋白濃度和純度;利用小鼠雜交瘤技術(shù)制備抗NCOA5的單克隆抗體,通過酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)、蛋白質(zhì)免疫印跡(Western Blot)、免疫熒光(Immunoflousece)和免疫組化(Immunohistochemistry)方法驗(yàn)證單克隆抗體識(shí)別NCOA5的敏感性及特異性;利用PCR技術(shù)分段擴(kuò)增NCOA5 C端基因片段,將其插入pMAL-c2X原核表達(dá)載體并進(jìn)行原核蛋白的表達(dá),通過Western Blot初步分析單克隆抗體所識(shí)別表位氨基酸序列;利用所制備的單抗行免疫組化檢測(cè)NCOA5在乳腺癌標(biāo)本中的表達(dá),統(tǒng)計(jì)其與相關(guān)臨床病理指標(biāo)的關(guān)系;應(yīng)用慢病毒技術(shù)干擾NCOA5在乳腺癌細(xì)胞系MDA-MB-231中的表達(dá),細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)(CCK-8 assay)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞增殖的影響,細(xì)胞劃痕(wound healing)及Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞遷移的影響。結(jié)果:成功構(gòu)建了pET-41a/NCOA5-C-ter重組質(zhì)粒用于原核蛋白的表達(dá),考馬斯亮藍(lán)染色顯示誘導(dǎo)細(xì)菌裂解后上清蛋白大小約69 kDa,與預(yù)期一致,說(shuō)明成功表達(dá)NCOA5重組蛋白,純化后考馬斯亮藍(lán)染色顯示蛋白純度高、可用于免疫小鼠;雜交瘤細(xì)胞經(jīng)間接ELISA檢測(cè)成功篩選出一株抗體8B11,抗體效價(jià)為1:32,000。Western Blot、免疫熒光及免疫組化方法提示單克隆抗體8B11能夠特異性識(shí)別細(xì)胞內(nèi)NCOA5,NCOA5定位于細(xì)胞核并在多個(gè)腫瘤細(xì)胞系中存在表達(dá);正確構(gòu)建了pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-N’及pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-C’重組質(zhì)粒用于分段表達(dá)NCOA5 C端原核蛋白,考馬斯亮藍(lán)染色顯示誘導(dǎo)細(xì)菌裂解后上清蛋白大小與預(yù)期一致,說(shuō)明重組蛋白表達(dá)成功,Western Blot顯示8B11能夠識(shí)別NCOA5蛋白第291-434個(gè)氨基酸組成的蛋白;乳腺癌標(biāo)本的免疫組化結(jié)果顯示,隨著腫瘤的增大,NCOA5表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)率升高(P=0.008);在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組中,NCOA5表達(dá)的陽(yáng)性表達(dá)率升高(P=0.042);隨著腫瘤TNM分期的增加,NCOA5的陽(yáng)性表達(dá)率逐漸上升(P=0.028);NCOA5在ER陰性標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率顯著升高(P=0.006);NCOA5在PR陰性標(biāo)本中陽(yáng)性表達(dá)率升高(P=0.025);NCOA5表達(dá)與年齡、組織學(xué)分級(jí)、HER-2無(wú)明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。慢病毒感染乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231后,Western Blot顯示沉默NCOA5表達(dá)有效,CCK-8法表明沉默NCOA5后細(xì)胞增殖能力下降(P0.05),細(xì)胞劃痕(wound healing)及Transwell實(shí)驗(yàn)表明沉默NCOA5后細(xì)胞遷移能力下降(P0.01)。結(jié)論:(1)利用pET-41a原核表達(dá)載體,成功表達(dá)并純化了NCOA5 C端重組蛋白;(2)利用雜交瘤技術(shù)成功制備了一株效價(jià)高、特異性好單克隆抗體8B11,可用于Western Blot、免疫熒光和免疫組化檢測(cè)NCOA5的表達(dá)情況,其抗原表位范圍為NCOA5蛋白第384-434個(gè)氨基酸;(3)NCOA5在肝癌、乳腺癌、結(jié)腸癌、胰腺癌細(xì)胞系中均存在表達(dá),NCOA5在乳腺癌中陽(yáng)性表達(dá)與腫瘤大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期及ER、PR的表達(dá)水平相關(guān),具有作為腫瘤標(biāo)志物的潛在價(jià)值;(4)沉默乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中NCOA5的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞增殖及遷移能力下降,提示NCOA5能夠通過ERα以外的途徑影響細(xì)胞的增殖和遷移能力,為進(jìn)一步探討NCOA5參與乳腺癌發(fā)生發(fā)展過程中的具體機(jī)制提供基礎(chǔ)。
[Abstract]:Objective: the application of mouse hybridoma technology for preparation of monoclonal antibodies to NCOA5 protein; the expression of NCOA5 in breast cancer tissues, and to analyze the correlation between NCOA5 and clinical pathological indicators; observe the silencing of NCOA5 for breast cancer cell proliferation, migration effect. Methods: using in vitro PCR amplification NCOA5 carboxyl end gene fragment of C. The fragment was inserted into the prokaryotic expression vector pET-41a; inducible expression of recombinant NCOA5 protein using IPTG; SDS-PAGE was used to analyze the expression of soluble and scale expression, using Ni-NTA affinity purified recombinant NCOA5 protein, using UV spectrophotometer, analysis of protein concentration and purity of SDS-PAGE electrophoresis and Coomassie blue staining; monoclonal the anti NCOA5 antibody in mice using hybridoma technique, by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), Western blotting, immunofluorescence (Western Blot) (Immuno Flousece) and immunohistochemistry (Immunohistochemistry) method to verify the sensitivity and specificity of NCOA5 monoclonal antibodies; C gene fragment amplified NCOA5 terminal using PCR technology, the expression of inserted into prokaryotic expression vector pMAL-c2X and prokaryotic protein by Western Blot, a preliminary analysis of monoclonal antibody epitopes using the amino acid sequence; preparation of monoclonal antibodies for immunohistochemical detection of NCOA5 expression in breast cancer specimens, the relationship between statistics and related clinical pathological factors; expression of lentiviral NCOA5 interference technology in breast cancer cell line MDA-MB-231, cell proliferation assay (CCK-8 assay) to detect its effect on cell proliferation, cell scratch (wound healing) and Transwell test to detect its effect on cell migration. Results: successfully constructed pET-41a/NCOA5-C-ter recombinant plasmid for prokaryotic expression, Coomassie brilliant blue Staining induced bacterial lysis after the supernatant protein size is about 69 kDa, consistent with expectations, indicating the successful expression of NCOA5 recombinant protein, purified by Coomassie brilliant blue staining showed that the protein of high purity, can be used for immunization of mice; hybridoma cells were screened by indirect ELISA detection of a 8B11 antibody, the antibody titer was 1:32000.Western Blot, immunofluorescence immunohistochemistry and prompt 8B11 monoclonal antibody could specifically recognize NCOA5 cells, NCOA5 localized in the nucleus and in the presence of multiple tumor cell lines expression; the correct construction of the recombinant plasmid pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-C pMAL-c2X/NCOA5-C-ter-N 'and' NCOA5 C end for segmented expression of prokaryotic protein, Kaumas shows Coomassie brilliant blue staining is consistent with the expected size of the supernatant protein induced by bacteria after cracking, that the recombinant protein was successfully expressed, Western Blot shows that 8B11 can recognize NCOA5 protein 291-434 amino Acid protein; immunohistochemical results of breast cancer were showed as the tumor increased, the expression of NCOA5 positive expression rate increased (P=0.008); in the group with lymph node metastasis, the expression of NCOA5 positive expression rate increased (P=0.042); with the increase of TNM staging, the positive expression rate of NCOA5 increased gradually (P=0.028); NCOA5 in ER negative samples positive expression rate was significantly increased (P=0.006); NCOA5 in PR negative samples positive expression rate increased (P=0.025); the expression of NCOA5 with age, histological grade, HER-2 had no statistical significance (P0.05). The lentiviral infection of breast cancer cell line MDA-MB-231, Western Blot silence the expression of NCOA5, CCK-8 showed a decrease in cell proliferation ability after silencing NCOA5 (P0.05), cell scratch (wound healing) and Transwell experiments showed that the decreased cell migration ability after silencing NCOA5 (P0.01). Conclusion: (1) using pET-41a prokaryotic expression As the carrier, NCOA5 C successfully expressed and purified the recombinant protein; (2) by hybridoma technique was successfully prepared a high titer and specificity of 8B11 monoclonal antibody can be used for Western Blot expression by immunofluorescence and immunohistochemical detection of NCOA5, the epitope of NCOA5 protein in the range of 384-434 amino acid; (3) NCOA5 in hepatocellular carcinoma, breast cancer, colon cancer, expressed in pancreatic cancer cell lines, NCOA5 in breast cancer expression and tumor size, lymph node metastasis, TNM staging and ER, related to the expression level of PR, which has potential value as a tumor marker; (4 the silence of NCOA5 expression in breast cancer cells) in MDA-MB-231 resulted in decreased proliferation and migration of cells, suggesting that NCOA5 can approach by ER alpha outside affect the ability of cell proliferation and migration, to further explore the NCOA5 specific mechanisms involved in breast cancer development process Basics.

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R737.9

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