本文關(guān)鍵詞：KIFC1高表達對非小細胞肺癌增殖及預(yù)后的影響　出處：《南方醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關(guān)文章： KIFC1 NSCLC p21 cdc2 細胞增殖 預(yù)后

【摘要】：研究背景和目的目前,肺癌(lung cacner)是全世界癌癥相關(guān)死亡的主要原因；最新研究顯示在中國肺癌是最常見的腫瘤。肺癌主要分為兩大類型,小細胞肺癌(small cell lung cancer, SCLC)和非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)。臨床上常見的類型為NSCLC,大約占肺癌總數(shù)的80-85%。肺癌的生存有賴于早期診斷和早期治療,但是由于肺癌早期缺乏典型的臨床癥狀,因此大約70%的患者就診時已處于晚期,極大的縮短了肺癌患者的生存時間。最新數(shù)據(jù)顯示在中國,經(jīng)過年齡矯正后5年生存率僅有15.4%。因此,進一步研究肺癌發(fā)生的分子機制以期對其早期篩查及臨床管理有所助益是很必要的。有絲分裂(mitosis)是真核細胞分裂產(chǎn)生體細胞的過程,是維持個體正常生長、發(fā)育和保證物種連續(xù)性、穩(wěn)定性的重要體現(xiàn)。有絲分裂的有序進行依賴很多基因網(wǎng)絡(luò)的調(diào)控。其中,周期蛋白依賴性蛋白激酶(cyclin-dependent kinase, CDK)是有絲分裂中的重要參與者,它包括了CDK1(又稱cdc2)、CDK2、CDK3等。Cdc2蛋白的表達可以促進有絲分裂過程中G2期向M期的轉(zhuǎn)化,過度表達可使細胞周期進程紊亂,進而導致細胞的異常增殖。周期依賴性蛋白激酶抑制因子1A(cyclin-dependent kinase inhibitor 1A, P21),可以減少cdc2的表達,對細胞周期起著負調(diào)控的作用。有絲分裂的紊亂在腫瘤發(fā)生發(fā)展中扮演著非常重要的作用。而多個研究證實驅(qū)動蛋白超家族蛋白(kinesin superfamily proteins, KIFs)中的多個成員是有絲分裂過程中昕必須的；因此,這些蛋白表達的改變可能會導致癌癥的發(fā)生。KIFs可以與微管結(jié)合,并通過沿著微管運動參與一些細胞器、蛋白復合物和信使RNA (messenger RNAs, mRNAs)的運輸；他們同樣涉及有絲分裂和減數(shù)分裂中染色體核紡錘絲的移動。KIFs超家族包含45個成員,驅(qū)動蛋白家族成員14(Kinesin family member 14, KIF14)與其他的成員有所不同,因為其負極末端的定向能動性。KIF14可以通過與胞質(zhì)分裂調(diào)控蛋白1(Protein Regulator of cytokinesis 1, PRC1)相互結(jié)合作用于中心紡錘體,從而調(diào)節(jié)胞質(zhì)分裂的過程。相關(guān)研究證實在視網(wǎng)膜母細胞瘤以及原發(fā)性肺癌組織中KIF14是過表達的,并且KIF14的表達可以作為肺癌生存的獨立預(yù)后因子。體外實驗也表明KIF14的敲除減少了腫瘤的發(fā)生。C末端驅(qū)動蛋白1(Kinesin family member C1, KIFC1)是哺乳動物細胞內(nèi)KIF14家族中的唯一成員,它有4個轉(zhuǎn)錄本,包含20個外顯子。KIFC1參與精子核膜形成以及頂體的延伸過程,同樣也是有絲分裂中染色體中板集合和有序排列過程所必需的。類似于KIFs對細胞內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)運,KIFC1同樣可以參與雙鏈DNA等的運輸。也有研究顯示,KIFC1與多種疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。例如,與人類白細胞抗原(human leukocyte antigen, HLA)目關(guān)基因結(jié)合,并參與纖毛不動綜合征(immotile cilia syndrome, ICS)的發(fā)生；在卵巢癌原發(fā)病灶以及轉(zhuǎn)移病灶中KIFC1的表達較周圍正常組織較高；無論早期還是晚期的肺癌中KIFC1的高表達預(yù)示著腦轉(zhuǎn)移的出現(xiàn)。多個實驗表明KIFC1參與癌癥發(fā)生發(fā)展的過程。公共數(shù)據(jù)庫上也顯示KIFC1在肺癌組織中高表達,并且與差的預(yù)后相關(guān)。然而,KIFC1的表達在NSCLC的發(fā)生發(fā)展中的作用機制還不是特別清楚�；诰W(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻的報道,我們采用不同的實驗技術(shù)在多中心的臨床標本中進行KIFC1表達的檢測,并在探討KIFC1在肺癌細胞系生長中所扮演的角色以及其具體的作用機制。研究方法1.原發(fā)性肺癌組織中KIFC1表達的檢測以及與生存預(yù)后的關(guān)系首先,利用公共數(shù)據(jù)庫公開和便捷的特點,在數(shù)據(jù)庫中查找KIFC1在肺癌組織中的表達情況以及表達高低與生存預(yù)后之間的關(guān)系；其次,我們收集2014年至2015年間,就診于南京軍區(qū)南京總醫(yī)院胸外科并行手術(shù)切除治療的肺癌患者的癌組織以及配對的正常組織,進行RNA和蛋白質(zhì)的提取,采用逆轉(zhuǎn)錄實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(quantitative reverse-transcription polymerase chain reaction, qRT-RCR)和聚丙烯酰胺凝膠電泳(western blotting, WB)的方法對KIFC1的表達進行檢測；再次,應(yīng)用免疫組織化學(immunohistochemistry, IHC)的方法,在組織微陣列芯片(tissue microarrays, TMA)中檢測KIFC1的表達,并分析其與預(yù)后的關(guān)系。2. KIFC1在肺癌細胞系生長中扮演的角色及其作用機制的研究首先,我們從中國科學院上海生命科學研究院生物化學與細胞生物學研究所選購狀態(tài)良好的三株人的NSCLC細胞系,包括A549、H1299和SPC-A1,并在合適的培養(yǎng)條件進行培養(yǎng)；其次,從上海吉瑪公司訂購KIFC1的siRNA和空白對照的siRNA對三個細胞株分別進行干擾,用qRT-RCR和western blotting的方法檢測干擾效率；再次,采用MTT、克隆形成以及流式細胞分析(flow-cytometric analysis, FCA)等技術(shù)對干擾后細胞系的生長速度、克隆形成能力以及細胞周期等進行分析；最后,通過比較轉(zhuǎn)染KIFC1的siRNA和空白對照的siRNA對細胞系生長速度和周期的影響并結(jié)合相關(guān)文獻報道,利用western blotting的方法對現(xiàn)象進行更進一步的分子機制的研究。結(jié)果1.原發(fā)性肺癌組織中KIFC1表達的檢測以及與生存預(yù)后的關(guān)系1.1公共數(shù)據(jù)庫中KIFC1在原發(fā)性肺癌組織中的表達情況Oncomine (www.oncomine.org)數(shù)據(jù)庫中包括Garber、Hou、Selamat和Okayama在內(nèi)的多個有關(guān)原發(fā)性肺癌的統(tǒng)計研究都顯示,無論是小細胞肺癌還是非小細胞肺癌,在肺癌組織中KIFC1 mRNA的表達均明顯高于配對的正常組織。1.2公共數(shù)據(jù)庫中KIFC1的表達與肺癌預(yù)后的關(guān)系Kaplan-Meier plotter (http://kmplot.com/analysis/index.php?p=background)數(shù)據(jù)庫中顯示,高表達KIFC1的非小細胞肺癌患者較低表達KIFC1的患者擁有更短的無進展生存期(progress-free survival, PFS)以及更差的總生存期(overall survival, OS),且兩者具有明顯的統(tǒng)計學差異。當對腺癌和鱗癌進行亞組分析時,腺癌患者中仍可得到相同的結(jié)果；而在鱗癌患者中,與KIFC1高表達相比,低表達KIFC1的患者擁有較長的PFS,但在OS方面并沒有顯著的統(tǒng)計學差異。1.3臨床標本中檢測KIFC1的表達采用qRT-RCR的方法分析40例臨床接受手術(shù)切除治療的NSCLC患者癌組織及配對的正常組織的mRNA的表達,結(jié)果顯示有28例患者癌組織中的KIFC1是過表達的,兩者具有明顯的統(tǒng)計學差異(P0.001)。Western blotting分析也顯示,蛋白質(zhì)水平KIFC1在癌組織的表達也明顯高于配對的正常組織。1.4組織芯片中KIFC1表達的檢測為了更進一步驗證KIFC1在肺癌組織較正常組織表達高,我們采取了多中心的研究方案。對上海芯超公司的肺癌微陣列組織芯片(TMA)進行免疫組化(IHC)的染色,結(jié)果發(fā)現(xiàn)在90例配對組織的患者中,有83例患者癌組織中KIFC1的表達高于其正常組織；癌組織中,若以免疫評分的平均值為截斷點,則有65.6%(56/90)的患者為KIFC1的高表達。1.5 TMA中患者KIFC1的表達與生存之間的關(guān)系TMA中包含90例肺癌患者,白手術(shù)之日起開始隨訪,隨訪時間為5-10年。剔除8例非腺癌患者后,剩余的82例肺腺癌患者中有51例患者存在KIFC1的高表達,31例患者屬于低表達,生存分析顯示KIFC1高表達的患者擁有更短的OS,兩組具有明顯的統(tǒng)計學差異(P=0.04)。2. KIFC1王肺癌細胞系生長中扮演的角色及其作用機制的研究2.1 KIFC1 siRNA可以有效的沉默肺癌細胞系中KIFC1的表達我們選取三株常用的NSCLC細胞系：A549、H1299和SPC-A1,分別用KIFC1 siRNA和空白對照的siRNA對細胞系進行干擾,24小時后提取RNA進行qRT-RCR,48小時后提取蛋白質(zhì)進行Western blotting;結(jié)果發(fā)現(xiàn),無論在蛋白質(zhì)水平還是在mRNA水平,與空白對照的siRNA處理組相比,經(jīng)過不同的si-KIFC1-1和si-KIFC1-2干擾后明顯降低了細胞株中KIFC1 mRNA的表達以及蛋白質(zhì)的合成,說明訂購的兩條KIFC1的siRNA均可有效的敲降肺癌細胞系中KIFC1的表達。2.2敲降NSCLC細胞系中KIFC1的表達可以抑制細胞的增殖在人類NSCLC細胞系中檢測敲降KIFC1后對細胞生長的影響。MTT實驗中顯示,與轉(zhuǎn)染了陰性對照的siRNA組相比,si-KIFC1-1和si-KIFC1-2的轉(zhuǎn)染明顯減慢了A549、H1299以及SPC-A1細胞的增長；而平板克隆實驗中同樣得出KIFC1的敲降極大地阻礙了細胞系克隆形成的能力。因此,這些結(jié)果說明KIFC1的低表達可以抑制人NSCLC細胞系的增殖。2.3 KIFC1的消耗可以導致細胞周期阻滯在G2/M期由于KIFC1的表達可以影響細胞的增長,因此,我們采用流式細胞技術(shù)檢測了KIFC1在肺癌細胞系A(chǔ)549和SPC-A1細胞周期進程中的調(diào)節(jié)作用。最終的實驗結(jié)果顯示敲除掉KIFC1后通過增加G2/M期細胞的比例,降低G0/G1期的細胞比例阻滯了A549和SPC-A1細胞的周期進程。這些結(jié)果表明KIFC1的低表達可以將細胞周期阻滯在G2/M期,也就是說KIFC1可能會通過調(diào)節(jié)細胞周期中G2/M期的進程參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展。2.4敲降KIFC1可以上調(diào)p21的表達并抑制cdc2的活性相關(guān)文獻報道cdc2在G2/M期的轉(zhuǎn)化中起著重要的作用,故而,我們檢測了小干擾RNA干擾后A549和SPC-A1細胞中cdc2的表達情況。與細胞周期的結(jié)果不謀而合,在A549和SPC-A1細胞中敲降KIFC1的表達后細胞周期蛋白cdc2的表達有所減少。我們同樣檢測了cdc2因子上游的幾個靶分子蛋白,所得結(jié)果顯示沉默掉KIFC1的表達后,與cdc2蛋白的變化趨勢相反,兩株細胞系中p21蛋白的表達均有所上調(diào)。結(jié)論我們的實驗表明在肺癌組織中KIFC1是呈高表達狀態(tài)的,而且其高表達狀態(tài)與差的預(yù)后相關(guān)。進一步探索其機制顯示在NSCLC細胞中KIFC1的下調(diào)可能會通過上調(diào)p21的表達抑制cdc2的活性,進而將細胞周期阻滯在G2/M期。這些都說明KIFC1可以作為診斷肺癌的生物標志之一,或者成為肺癌的一個獨立預(yù)后因子,并為肺癌治療的進一步研究提供了一定的理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1412762