本文關(guān)鍵詞：熱休克蛋白Mortalin在肝癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制研究　出處：《昆明醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： Mortalin CD151 肝癌 PI3K/ATK 遷移 侵襲

【摘要】：目的：通過(guò)慢病毒基因轉(zhuǎn)載抑制熱休克蛋白Mortalin的表達(dá),并用western blot檢測(cè)其與四跨膜蛋白CD151在肝癌細(xì)胞中的相互關(guān)系,以及對(duì)磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)信號(hào)通路的影響,并研究其對(duì)肝癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響。方法：1.通過(guò)吉滿生物科技(上海)有限公司,體外利用easy RNAi慢病毒構(gòu)建技術(shù)將干擾Mortalin合成依次標(biāo)記為TRAP1、TRAP2、TRAP3的三個(gè)靶點(diǎn)序列基因分別用載體PGMLV-SC5 (2494):hU6-MCS-CMV-ZsGreen 1-PGK-Puro進(jìn)行包裝,轉(zhuǎn)染至人肝癌細(xì)胞株HepG2中,轉(zhuǎn)染細(xì)胞組標(biāo)記為TRAP1細(xì)胞組、TRAP2細(xì)胞組、TRAP3細(xì)胞組,通過(guò)熒光表達(dá)率和western blot技術(shù),選取TRAP1細(xì)胞組、TRAP2細(xì)胞組、TRAP3細(xì)胞組3組細(xì)胞中,轉(zhuǎn)染效率最高即Mortalin表達(dá)下降最多的細(xì)胞組作為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組。然后再運(yùn)用western blot技術(shù)比較未進(jìn)行轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組),未攜帶靶點(diǎn)序列病毒顆粒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(陰性對(duì)照組)和Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組),三組細(xì)胞中CD151的表達(dá)情況。2. 由第一部分實(shí)驗(yàn)篩選出的Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組)與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組),通過(guò)用western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其PI3K/AKT信號(hào)通路中的關(guān)鍵蛋白：蛋白激酶B(AKT)及磷酸化蛋白激酶B(P-AKT)的表達(dá),討論Mortalin下調(diào)對(duì)HepG2細(xì)胞中PI3K/AKt信號(hào)通路的影響。3.分別應(yīng)用劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell小室檢測(cè)抑制Mortalin表達(dá)后人肝癌細(xì)胞HepG2的遷移能力與侵襲能力的改變情況。結(jié)果：1.用于抑制Mortalin表達(dá)的三個(gè)靶點(diǎn)序列TRAP1、TRAP2、TRAP3轉(zhuǎn)染的三組人肝癌細(xì)胞HepG2中,TRAP2序列轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2 (TRAP2細(xì)胞組)中Mortalin的表達(dá)下降最明顯,并設(shè)為接下來(lái)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)組。未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組),未攜帶靶點(diǎn)序列病毒顆粒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(陰性對(duì)照組)和Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(實(shí)驗(yàn)組),通過(guò)Western blot進(jìn)行比較后,CD151的表達(dá)未見(jiàn)明顯下調(diào),統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)差異。2. Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(TRAP2細(xì)胞組)與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組相比較, PI3K/AKT信號(hào)傳導(dǎo)通路中AKT略有下調(diào),但是不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。P-AKT隨Mortalin表達(dá)下降有所下調(diào),有明顯差異,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。3. Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(TRAP2細(xì)胞組)作為實(shí)驗(yàn)組、未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組為空白組對(duì)照組,未攜帶靶點(diǎn)序列病毒顆粒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組為陰性對(duì)照組。在Transwell室檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力實(shí)驗(yàn)中：將空白組與陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組,兩兩進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)組侵襲能力明顯下將。在劃痕實(shí)驗(yàn)中：在0小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),36小時(shí)四個(gè)時(shí)間段,對(duì)實(shí)驗(yàn)組與空白對(duì)照組劃痕寬度進(jìn)行比較,實(shí)驗(yàn)組遷移能力未見(jiàn)明顯改變。結(jié)論：1.在人肝癌細(xì)胞中,抑制HepG2表達(dá)后,CD151表達(dá)未出現(xiàn)明顯Mortalin下調(diào),二者表達(dá)無(wú)相關(guān)關(guān)系。2. 抑制人肝癌細(xì)胞中HepG2的表達(dá)后,Mortalin信號(hào)傳導(dǎo)通PI3K/AKT路中AKT無(wú)明顯下調(diào),說(shuō)明的下調(diào)對(duì)人肝癌細(xì)胞Mortalin中總AKT量HepG2并不產(chǎn)生影響,而隨P-AKT表達(dá)下降有所下調(diào),差別明顯,說(shuō)明Mortalin的下調(diào)會(huì)引起人肝癌細(xì)胞Mortalin內(nèi)HepG2信號(hào)傳導(dǎo)通路中AKT磷酸化的下PI3K/AKT降,而這種差別并不是由于總AKT量的表達(dá)不等造成,是由于抑制人肝癌細(xì)胞中HepG2的表達(dá)后,會(huì)抑制AKT活化,從而抑制Mortalin信號(hào)傳導(dǎo)PI3K/AKT通路的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。3.在細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn)中：未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組)與未攜帶靶點(diǎn)序列病毒顆粒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(陰性對(duì)照組)侵襲細(xì)胞數(shù)無(wú)明顯差異(p0.05),說(shuō)明空載病毒本身并不會(huì)對(duì)人肝癌細(xì)胞HepG2的侵襲能力產(chǎn)生改變,未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組)侵襲細(xì)胞數(shù)較Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(TRAP2細(xì)胞組)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組侵襲有明顯差異(p0.05),未攜帶靶點(diǎn)序列病毒顆粒轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(陰性對(duì)照組)侵襲細(xì)胞數(shù)較Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(TRAP2細(xì)胞組)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組侵襲也有明顯差異(p0.05),與空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組比較結(jié)果相符合。說(shuō)明抑制人肝癌細(xì)胞HepG2中Mortalin的表達(dá),對(duì)其體外侵襲能力有顯著影響。在細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)中：比較Mortalin表達(dá)下降最多的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(TRAP2細(xì)胞組)實(shí)驗(yàn)細(xì)胞組與未進(jìn)行轉(zhuǎn)染的人肝癌細(xì)胞HepG2細(xì)胞組(空白對(duì)照組)在0小時(shí),12小時(shí),24小時(shí),36小時(shí)劃痕寬度,均無(wú)明顯差異(p0.05),說(shuō)明抑制Mortalin的表達(dá),并不能抑制人肝癌細(xì)胞HepG2體外遷移能力。
[Abstract]:Objective : To investigate the expression of the heat shock protein ( Mortalin ) in human hepatocellular carcinoma cell line HepG2 by means of slow virus gene transfer , and to investigate its effects on the migration and invasion of human hepatocellular carcinoma cells . The method includes the following steps : 1 . The cells of the three target sequences labeled TRAP1 , TRAP2 , TRAP3 are labeled as TRAP1 , TRAP2 , TRAP3 by western blot . Results : 1 . The expression of Mortalin in HepG2 cells transfected with TRAP1 , TRAP2 and TRAP3 was significantly lower than that in HepG2 cells ( control group ) . The results showed that the expression of Mortalin in HepG2 cells transfected with three target sequences TRAP1 , TRAP2 and TRAP3 was significantly lower than that in HepG2 cells ( experimental group ) . Compared with the untreated human liver cancer cell line HepG2 cells , there was a slight downregulation in the signal transduction pathway of human liver cancer cells ( TRAP2 cells ) with the highest expression of Mortalin , but there was no statistical difference . In the experiment of invasion ability of human liver cancer cells , the expression of CD151 in the experimental group was significantly lower than that in the negative control group , the experimental group and the blank control group . There was no significant difference in the invasion ability of HepG2 cells ( P < 0.05 ) . The expression of Mortalin in HepG2 cell group ( control group ) was significantly lower than that in HepG2 cells ( control group ) .

【學(xué)位授予單位】：昆明醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R735.7

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本文編號(hào)：1405555