本文關鍵詞：重金屬銻通過上調CtBP2表達促進前列腺癌進展機制　出處：《天津醫(yī)科大學》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： 前列腺癌 銻 金屬效應元件 CtBP2 c-Myc

【摘要】：目的明確低劑量重金屬銻暴露后,對前列腺癌進展產生的影響,并初步探討其作用機制。方法采用MTT方法篩選銻暴露PC3細胞的亞致死劑量,并明確在該劑量下銻對PC3細胞增殖效應的影響;明確銻暴露影響細胞增殖最顯著劑量后,用該劑量銻處理PC3細胞,分別通過細胞劃痕實驗、Transwell實驗以及磷脂酰絲氨酸外翻法分析,研究銻暴露對細胞遷移能力、侵襲能力及凋亡能力的作用;采用基因轉錄組測序的方法,研究低劑量銻暴露PC3細胞后,基因異常表達情況;根據基因測序結果,分別采用RT-qPCR及Western Blot方法,研究低劑量銻暴露對CtBP2以及下游蛋白轉錄翻譯水平的影響;通過比對CtBP2轉錄起始上游DNA序列,查詢金屬效應元件(MRE)結構,構建MRE表達質粒后轉染HEK293T細胞,予以低劑量銻暴露后,進行雙熒光素酶報告基因實驗,證明MRE結構與低劑量銻暴露的關系;建立銻暴露裸鼠荷瘤實驗模型后,明確低劑量銻對裸鼠及皮下腫瘤生長的影響,并記錄裸鼠體重及皮下種植瘤體積變化,繪制生長曲線,采用Western Blot方法檢測其腫瘤組織中CtBP2以及下游蛋白表達水平。結果低劑量銻暴露可促進PC3細胞增殖,并發(fā)現在銻暴露劑量為8uM時,其促進增殖效應最為顯著(P0.05);以8uM銻暴露PC3細胞后,細胞遷移以及侵襲能力均顯著增加(P0.05),但并不能增加其抗凋亡能力;根據基因轉錄組測序結果,低劑量銻暴露PC3細胞后,多種基因出現顯著的差異性表達,其中包括CtBP2表達水平顯著增加(P0.05);根據RT-qPCR方法驗證,低劑量銻暴露后PC3細胞中CtBP2 mRNA顯著增加,結合Western Blot實驗結果提示,CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111蛋白表達水平顯著增高(P0.05);通過比對CtBP2 DNA序列,證明其轉錄起始上游具有金屬效應元件(MRE)結構,因此CtBP2為MRE調控的效應基因;成功構建金屬效應元件表達質粒后,雙熒光素酶報告基因系統(tǒng)結果證明,低劑量銻可以與該結構發(fā)生相互作用,進一步促進下游CtBP2表達增加;建立低劑量銻暴露裸鼠荷瘤實驗模型后,對照組與10mg/kg/d組裸鼠皮下種植瘤體積分別為(1344.9±882.8)mm3以及(2612.4±777.5)mm3,具有統(tǒng)計學差異(P0.05),結果證實低劑量銻可顯著促進裸鼠種植瘤生長;而通過Western Blot實驗證明在低劑量銻暴露后的裸鼠腫瘤組織中,CtBP2以及下游c-Myc、HSPC111蛋白表達水平顯著升高(P0.05)。結論低劑量銻暴露可顯著影響前列腺癌細胞的生物學行為,促進前列腺癌進展。該作用機制是低劑量銻與金屬效應元件(MRE)相互作用上調CtBP2表達,并通過調節(jié)CtBP2-c-Myc信號通路,發(fā)揮其促進腫瘤進展的作用。
[Abstract]:Objective to make clear the low dose of heavy metal antimony exposure after impact on the progression of prostate cancer, and to explore its mechanism. Methods MTT method for screening antimony exposure of PC3 cells to sublethal dose, and clarify the influence in the dose effect of antimony on the proliferation of PC3 cells; clear cell proliferation is the most significant effect of antimony exposure dose, with the dose of antimony PC3 cells were treated respectively by cell scratch test, Transwell test and analysis of phosphatidylserine method of antimony exposure on cell migration, invasion and apoptosis ability; using the base method for transcriptome sequencing, the study of low dose of antimony exposed PC3 cells, abnormal expression of genes according to the situation; the sequencing results, using RT-qPCR and Western Blot respectively, the study of low dose exposure to CtBP2 and the downstream effects of antimony protein transcription and translation level of CtBP2 transcription by ratio; Only the upstream DNA sequence query metal response element (MRE) structure, construction of MRE expression plasmid was transfected into HEK293T cells to low dose of antimony after exposure by dual luciferase reporter assay, prove the relationship between MRE structure and low dose exposure to antimony; antimony exposure to establish nude mice model, a clear effect of low dose of antimony growth and in nude mice subcutaneous tumor in nude mice, and record the weight and subcutaneous tumor volume changes, growth curve, the expression of CtBP2 and its downstream protein level in tumor tissue by Western Blot method. The results of low dose exposure to antimony can promote the proliferation of PC3 cells, and found that the antimony exposure dose was 8uM, the proliferation effect of the significant (P0.05); 8uM antimony exposed PC3 cells, cell migration and invasion were significantly increased (P0.05), but did not increase the ability of anti apoptosis; according to gene transcriptome sequencing results, Low dose of antimony exposed PC3 cells, a variety of gene differential expression significantly, including the expression level of CtBP2 increased significantly (P0.05); according to the method of RT-qPCR CtBP2 verification, PC3 cells mRNA increased significantly after exposure to low doses of antimony, combined with the Western Blot results suggest that CtBP2 and c-Myc downstream, the expression level of HSPC111 protein increased significantly (P0.05); by comparing the CtBP2 DNA sequence, prove its upstream transcription start with metal response element (MRE) structure, so the effect of CtBP2 MRE gene; metal element expression plasmid was constructed successfully after the dual luciferase reporter assay results show that low dose of antimony can interact with the structure, to further promote the downstream the expression of CtBP2 increased; establishment of low dose exposure to antimony nude mice model, the control group and 10mg/kg/d group in nude mice tumor is integral (1344.9 + 882.8) mm 3 and (2612.4 + 777.5) mm3, with statistical difference (P0.05). The results confirmed that low dose of antimony can significantly promote the growth of nude mice; and demonstrated in the tumor tissue of mice after exposure to low doses of antimony by Western Blot experiment, CtBP2 and downstream c-Myc, HSPC111 protein expression increased significantly (P0.05). Low dose exposure to antimony can significantly affect the biological behavior of prostate cancer cells, promote the progression of prostate cancer. The mechanism of low-dose and antimony metal response element (MRE) interactions upregulate the expression of CtBP2, and by regulating the CtBP2-c-Myc signaling pathway, play its role in tumor progression.

【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R737.25

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本文編號：1401712