本文關(guān)鍵詞：探討白血病細(xì)胞NPM1突變蛋白在TRAF6泛素化激活A(yù)kt過(guò)程中的作用　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：第一部分白血病細(xì)胞NPM1突變蛋白與Akt蛋白的相互作用核仁磷酸蛋白(nucleophosmin,NPM1)突變是急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)中最常見(jiàn)的基因突變,基因突變導(dǎo)致NPM1蛋白異常的胞質(zhì)聚集是該型白血病細(xì)胞最顯著的生物學(xué)特征。PKB/Akt(Protein Kinase B)是參與細(xì)胞增殖、凋亡、分化、腫瘤遷徙轉(zhuǎn)移和血管形成等一系列細(xì)胞生存相關(guān)進(jìn)程的重要信號(hào)分子,而且臨床上大約有一半的AML患者白血病細(xì)胞中存在Akt的組成性激活。前期研究中我們發(fā)現(xiàn)干擾白血病細(xì)胞中NPM1突變蛋白表達(dá),Akt磷酸化水平隨之下降,但其中的機(jī)制并不清楚。有文獻(xiàn)報(bào)道野生的NPM1蛋白能與Akt的PH結(jié)構(gòu)域相互結(jié)合,那么,突變的NPM1蛋白是否也能與Akt的PH結(jié)構(gòu)域結(jié)合,參與調(diào)控Akt活性呢?本課題首先在天然攜帶NPM1基因突變的OCI-AML3白血病細(xì)胞中,采用雙向免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察內(nèi)源性NPM1突變蛋白與Akt的相互作用。為了進(jìn)一步確定Akt與NPM1突變蛋白相互作用的結(jié)構(gòu)域,在293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染Flag-NPM1mA、HA-Akt或HA Akt-△PH,免疫共沉淀檢測(cè)外源性NPM1突變蛋白與Akt的相互作用。結(jié)果顯示,OCI-AML3細(xì)胞中內(nèi)源性NPM1突變蛋白可與Akt相互作用;293T細(xì)胞中外源性的NPM1突變蛋白與Akt相互結(jié)合,而PH結(jié)構(gòu)域缺失的Akt不能與NPM1突變蛋白結(jié)合。提示白血病細(xì)胞中存在NPM1突變蛋白與Akt的相互結(jié)合,且結(jié)合部位在Akt的PH結(jié)構(gòu)域。第二部分NPM1突變的白血病細(xì)胞中存在TRAF6介導(dǎo)的Akt泛素化激活A(yù)kt信號(hào)通路持續(xù)性激活與白血病的發(fā)生密切相關(guān),而AML中大約70%的Akt組成性激活與白血病細(xì)胞胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin like growth factor-1,IGF-1)的自分泌有關(guān)。最近研究發(fā)現(xiàn)在IGF-1等生長(zhǎng)因子作用下,腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(tumor necrosis factor receptor-associated factor-6,TRAF6)可以作為E3泛素連接酶使Akt分子發(fā)生K63位多聚泛素化修飾,泛素化的Akt分子隨后移位到細(xì)胞膜,被PDK1和m TORC2磷酸化激活。為探討白血病中是否存在TRAF6介導(dǎo)的Akt泛素化激活,Western blot檢測(cè)白血病細(xì)胞株中TRAF6、p-Akt(T308)和p-Akt(S473)的表達(dá)水平;免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)觀察TRAF6與Akt的相互作用;Western blot檢測(cè)干擾TRAF6表達(dá)后Akt磷酸化和泛素化水平的改變,以及干擾TRAF6表達(dá)對(duì)Akt細(xì)胞膜定位的影響。結(jié)果顯示,六種白血病細(xì)胞株中存在TRAF6、p-Akt(S473)、p-Akt(T308)不同程度的表達(dá);在OCI-AML3細(xì)胞中存在內(nèi)源性TRAF6與Akt的相互作用,當(dāng)采用IGF-1生長(zhǎng)因子刺激時(shí),兩者相互作用增強(qiáng);在OCI-AML3細(xì)胞中干擾TRAF6蛋白表達(dá),可降低Akt的磷酸化水平、抑制Akt的泛素化水平,以及阻滯Akt分子在細(xì)胞膜的定位。提示NPM1突變白血病細(xì)胞中TRAF6能夠介導(dǎo)Akt發(fā)生泛素化激活。第三部分NPM1突變蛋白作為“adaptor”促進(jìn)泛素化Akt的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位和磷酸化激活已知在IGF-1等生長(zhǎng)因子作用下,TRAF6可以使Akt分子發(fā)生K63多聚泛素化修飾,隨后泛素化的Akt移位到細(xì)胞膜上,進(jìn)而被磷酸化激活。而抑制TRAF6蛋白表達(dá)或抑制Akt分子K63位泛素化后Akt的細(xì)胞膜定位明顯減少。提示Akt的泛素化參與調(diào)控Akt的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位過(guò)程。然而,Akt的泛素化調(diào)控Akt移位到細(xì)胞膜上的具體機(jī)制尚不清楚。有研究人員提出,Akt發(fā)生泛素化修飾以后,泛素化的Akt可能成為一個(gè)平臺(tái),招募胞質(zhì)中的某些蛋白,而被招募的蛋白作為一個(gè)“adaptor”協(xié)助泛素化的Akt定位到細(xì)胞膜上。本課題第一部分已經(jīng)證實(shí),NPM1突變蛋白能夠結(jié)合Akt分子,因此NPM1突變蛋白有可能作為一個(gè)“adaptor”協(xié)助泛素化的Akt定位到細(xì)胞膜上。為了探究NPM1突變蛋白在泛素化調(diào)控Akt細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位過(guò)程中的作用,首先在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NPM1突變質(zhì)粒,Western blot檢測(cè)Akt泛素化水平改變;干擾白血病OCI-AML3細(xì)胞中NPM1突變蛋白表達(dá),Western blot檢測(cè)Akt磷酸化水平和細(xì)胞膜定位改變;293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NPM1突變質(zhì)粒,Western blot檢測(cè)Akt細(xì)胞膜定位的改變。結(jié)果顯示,過(guò)表達(dá)NPM1突變對(duì)Akt的泛素化水平?jīng)]有顯著影響;干擾NPM1突變蛋白表達(dá)能抑制IGF-1誘導(dǎo)的Akt磷酸化激活,同時(shí),還能減少Akt分子在細(xì)胞膜上的定位;在293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)NPM1突變能增強(qiáng)Akt分子的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)位。提示NPM1突變蛋白不影響Akt的泛素化水平,而是作為一種“adaptor”協(xié)同促進(jìn)泛素化的Akt移位到細(xì)胞膜,進(jìn)而增強(qiáng)Akt的磷酸化活性。
[Abstract]:絎竴閮ㄥ垎鐧借鐥呯粏鑳?yōu)NPM1紿佸彉铔嬬櫧涓嶢kt铔嬬櫧鐨勭浉浜掍綔鐢ㄦ牳浠佺７閰歌泲鐧，

本文編號(hào)：1360341