本文關(guān)鍵詞：重組腺病毒Ad-IL-12對(duì)M2型巨噬細(xì)胞表型及功能的逆轉(zhuǎn)　出處：《重慶醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

  更多相關(guān)文章： 重組腺病毒Ad-IL-12 巨噬細(xì)胞 M2 M1 逆轉(zhuǎn)

【摘要】：目的：探討重組腺病毒Ad-IL-12轉(zhuǎn)入M2型巨噬細(xì)胞后能否逆轉(zhuǎn)其表型及功能和涉及的信號(hào)分子。方法：利用外源性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的方法構(gòu)建M2型巨噬細(xì)胞模型,在此基礎(chǔ)上轉(zhuǎn)染攜帶目的基因IL-12的腺病毒,作用60 h后,通過(guò)PCR技術(shù)檢測(cè)M1/M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)指標(biāo)的變化,用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表面胞膜分子表達(dá)的變化。通過(guò)收集條件培養(yǎng)基的方法,間接檢測(cè)M2型巨噬細(xì)胞功能的改變,采用CCK-8方法觀察條件培養(yǎng)基處理后肝癌細(xì)胞HepG2的增殖,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)條件培養(yǎng)基處理后肝癌細(xì)胞的周期及凋亡,最后,用western blot方法檢測(cè)在此M2巨噬細(xì)胞表型逆轉(zhuǎn)過(guò)程中可能的信號(hào)分子表達(dá)的變化。結(jié)果：成功構(gòu)建了M2型巨噬細(xì)胞模型。從熒光顯微鏡圖片及IL-12p35、p40的表達(dá)情況說(shuō)明,攜人IL-12基因的腺病毒成功轉(zhuǎn)染M2型巨噬細(xì)胞且其所攜帶基因IL-12得到有效表達(dá)。病毒作用60h后,與空白組和空載組相比,過(guò)表達(dá)IL-12組的M2型巨噬細(xì)胞表達(dá)M1巨噬細(xì)胞極化相關(guān)指標(biāo)(如促炎因子：IL-23, IL-1β等)增多,而M2巨噬細(xì)胞極化相關(guān)指標(biāo)(如抗炎因子：IL-10, TGF-β)表達(dá)下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,流式細(xì)胞術(shù)也證明實(shí)驗(yàn)組的胞膜分子CD86表達(dá)增高,CD206表達(dá)下降。3組不同來(lái)源的條件培養(yǎng)基處理肝癌細(xì)胞HepG2約72h后,CCK-8實(shí)驗(yàn)顯示：從第3d開始,過(guò)表達(dá)IL-12組的HepG2細(xì)胞增殖開始受到明顯抑制,與空白和空載組比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而后兩者比較,差異不大(P0.05)；同樣方法處理HepG272h后,流式結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)IL-12組肝癌細(xì)胞早期凋亡明顯增加(早期凋亡率達(dá)11.33±0.92%),細(xì)胞周期主要分布在G1期(占細(xì)胞總數(shù)的65.88±2.69%),與空載組的早期凋亡率(3.01±1.03%)、G1期細(xì)胞分布(48.42±2.05%),空白組的早期凋亡率(2.91±0.92%)、G1期細(xì)胞分布(44.63±2.34%)相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而后兩者之間差異不大。Western blot結(jié)果顯示：過(guò)表達(dá)IL-12組的M2型巨噬細(xì)胞信號(hào)分子p-stat3、wnt2、β-catenn、c-myc和NF-κBP50的表達(dá)量明顯降低,而信號(hào)分子p-statl和NF-κBP65的表達(dá)量明顯升高,與空白組和空載組比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而后兩組之間差異不大。結(jié)論：在成功地構(gòu)建M2型巨噬細(xì)胞模型基礎(chǔ)上,通過(guò)轉(zhuǎn)入攜人IL-12的腺病毒,證實(shí)過(guò)表達(dá)IL-12基因可逆轉(zhuǎn)M2型巨噬細(xì)胞的表型,同時(shí)伴隨有其功能的改變,使M2型巨噬細(xì)胞向M1型巨噬細(xì)胞的方向轉(zhuǎn)化。在此過(guò)程中,也伴隨有部分信號(hào)分子的改變。
[Abstract]:Objective: to investigate whether recombinant adenovirus Ad-IL-12 can reverse the phenotype, function and signal molecules involved in M 2 macrophages. The M2 macrophage model was constructed by exogenous cytokine induction. On this basis, adenovirus carrying the target gene IL-12 was transfected. After 60 hours of exposure, the changes of polarization related indexes of M 1 / M 2 macrophages were detected by PCR technique. Flow cytometry was used to detect the changes of cellular membrane molecule expression on the cell surface, and the function of M2 macrophage was indirectly detected by the method of conditional culture medium. CCK-8 method was used to observe the HepG2 proliferation of hepatoma cells treated with conditioned medium. Flow cytometry was used to detect the cycle and apoptosis of hepatoma cells treated with conditioned medium. Western blot method was used to detect the changes of signal molecule expression during phenotypic reversal of M2 macrophages. The M _ 2 macrophage model was successfully constructed from fluorescence microscopy and IL-12p35. The expression of p40 indicated that the adenovirus carrying human IL-12 gene was successfully transfected into M2 macrophage and its gene IL-12 was effectively expressed. Compared with blank group and no-load group, M _ 2 macrophages with overexpression of IL-12 expressed more M _ 1 macrophage polarization-related indexes (such as pro-inflammatory factor: IL-23, IL-1 尾). However, the expression of anti-inflammatory factor: IL-10, TGF- 尾 in M2 macrophages decreased, and the difference was statistically significant. Flow cytometry also showed that the expression of CD86 in the membrane of experimental group increased and CD206 expression decreased. 3. The HepG2 of hepatoma cells was treated with conditioned medium from different sources for 72 hours. CCK-8 assay showed that from the 3rd day, the proliferation of HepG2 cells in overexpression IL-12 group was inhibited obviously, compared with blank group and no-load group, the difference was statistically significant (P 0.05). However, the difference between the latter two was not significant (P 0.05). After HepG272h was treated with the same method, the flow rate showed that the early apoptosis of hepatoma cells increased significantly (the rate of early apoptosis was 11.33 鹵0.92) in the over-expressed IL-12 group. The cell cycle was mainly distributed in G1 phase (65.88 鹵2.69% of the total cells, and 3.01 鹵1.03% in the no-load group). The cell distribution in G1 phase was 48.42 鹵2.05, and the early apoptotic rate was 2.91 鹵0.92 in the blank group, compared with 44.63 鹵2.34 in the G1 phase. The difference was statistically significant, but the difference between the latter two was not significant. The results of Western blot showed that the signal molecule p-stat3 of M2 type macrophages in IL-12 group was over-expressed. The expressions of wnt2, 尾 -catennin c-myc and NF- 魏 BP50 decreased significantly, while the expression of signal molecules p-statl and NF- 魏 BP65 increased significantly. Compared with blank group and no-load group, the difference was statistically significant, but there was no significant difference between the latter two groups. Conclusion: on the basis of successfully constructing M2 macrophage model, the adenovirus carrying human IL-12 was transferred. It is proved that overexpression of IL-12 gene can reverse the phenotype of M 2 macrophages, accompanied by changes in its function, which makes M 2 macrophages transform to M 1 type macrophages. There are also changes in some signaling molecules.
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R730.5

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本文編號(hào)：1360184