本文關鍵詞：DRAM1介導肺癌A549細胞的上皮間質轉化作用及其機制研究　出處：《川北醫(yī)學院》2016年碩士論文　論文類型：學位論文

  更多相關文章： DRAM1 肺癌 上皮間質轉化 自噬 轉移 TGF-β

【摘要】：研究背景:肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球各種惡性腫瘤中位居榜首。肺癌患者治療失敗的主要原因是發(fā)生侵襲轉移,如何抑制肺癌的侵襲轉移是目前肺癌治療亟待解決的問題。研究發(fā)現上皮-間質轉化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)現象在上皮源性腫瘤細胞中普遍存在,其重要特征就是腫瘤細胞的細胞膜E-cadherin、β-catenin等上皮標記表達下調,獲得間質細胞表型,表達vimentin,細胞黏附能力減弱,遷移和侵襲能力增強。因此,探討EMT及其信號途徑在肺癌中的分子機制和逆轉策略具有重要的科學意義和臨床應用前景。自噬(autophagy)是一種進化上保守的、維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。其主要是通過形成雙層膜結構,將細胞內需要被降解的蛋白或受損細胞器包裹起來,轉運至溶酶體進行降解,之后將降解產物被用作細胞生物合成和細胞器的更新,從而維持細胞的穩(wěn)定。目前研究表明,自噬的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關系,通過調控自噬水平,可以影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲。因此,自噬成為腫瘤研究領域的熱點。損傷相關自噬調節(jié)因子(Damage-Regulated Autophagy Modulator,DRAM)是一類高度保守的基因,其公認的作用是通過誘導自噬溶酶體的聚集,從而激活細胞自噬。DRAM家族中目前發(fā)現了5個基因,其中DRAM1是目前DRAM家族中最受關注的基因。既往研究表明DRAM1在肺癌等多種腫瘤組織呈低表達,其主要功能是調控自噬,誘導p53和p73依賴的自噬性凋亡。目前研究表明,調節(jié)自噬相關基因p62/sqstm1可影響腫瘤細胞的emt。此外,tgf-β1在誘導腫瘤細胞emt的同時,也影響了細胞內的自噬流。上述結果提示自噬和emt直接關系密切。那么,作為自噬調節(jié)基因的dram1,是否可以通過調控p62/sqstm1進而影響肺癌細胞emt的作用呢?基于上述科學設想,本研究擬通過調控dram1表達,探討其對肺癌a549細胞自噬和emt的影響,以及其在tgf-β1誘導的emt中發(fā)揮作用和機制,初步闡述dram1在調控肺癌a549細胞emt中的作用和潛在的機制。實驗結果有望為肺癌侵襲和遷移的防治提供新的思路和潛在的治療靶標。研究目的:1.明確dram1在調節(jié)a549細胞emt中的作用;2.探討dram1調節(jié)a549細胞emt的潛在機制。研究方法:1.培養(yǎng)a549細胞,應用實時定量pcr檢測1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mltgf-β1分別處理24h和5ng/mltgf-β1分別處理12、24和48h后,a549細胞中內源性dram1的表達情況;2.提取過表達質粒pegfp-n1-dram1(dram1)和空載體pegfp-n1(vector)質粒,并轉染a549細胞。應用免疫熒光顯微鏡觀察轉染效率,利用應用實時定量pcr和westernblot檢測轉染質粒后,dram1、e-cadherin、vimentin、atg5、p62、twist以及l(fā)c3b的表達;3.應用劃痕實驗和transwell小室,檢測轉染dram1質粒后對a549細胞遷移能力的影響;4.5ng/mltgf-β1處理a549細胞24h后,利用實時定量pcr檢測atg5、p62和twistmrna的表達變化,并用westernblot檢測atg5、p62、twist以及l(fā)c3b蛋白的表達;5.轉染dram1sirna和sirna陰性對照(negativecontrol,nc)后,再用5ng/mltgf-β1處理a549細胞24h后,利用實時定量pcr和westernblot檢測e-cadherin、vimentin、p62和twist的表達;研究結果:1.用1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mltgf-β1分別處理a549細胞后,dram1mrna的表達顯著高于未處理組(contorl,ctl)(p0.05);隨著重組人tgf-β1濃度逐漸升高(從1ng/ml到5ng/ml),dram1的表達也隨之升高(p0.05);5ng/ml組與10ng/ml組的dram1mrna的表達水平無顯著差異(p0.05)。應用5ng/ml的tgf-β1分別處理a549細胞12、24h、48h后,發(fā)現dram1mrna的相對表達水平隨著時間的延長而增加(p0.05),呈時間依賴性。2.我們成功擴增和提取空載體pegfp-n1(vector)質粒和pegfp-n1-dram1質粒。將上述兩種質粒分別轉染a549細胞48h后,使用熒光顯微鏡觀察到兩種質粒均成功轉染進入a549細胞。pegfp-n1-dram1質粒轉染a549細胞后,dram1、vimentin、atg5、p62、twist和lc3bii/i表達顯著高于未轉染質粒對照組和vector組(p0.05)。3.發(fā)現轉染pegfp-n1-dram1質粒后,a549細胞的遷移的能力較未轉染質粒對照組和vector組顯著增強。4.使用5ng/ml重組人tgf-β1處理a549細胞24h后,qpcr檢測顯示atg5、p62和twistmrna表達水平較對照組顯著升高(p0.05);western blot檢測發(fā)現,自噬相關蛋白LC3B、Atg5、p62以及Twist表達水平較對照組顯著升高(p0.05)。5.Twist、p62以及vimentin mRNA和蛋白表達在TGF-β1+NC組、TGF-β1+DRAM1 siRNA組較未轉染siRNA對照組顯著增高(p0.05),并且Twist、p62以及vimentin mRNA和蛋白表達在TGF-β1+NC組的水平高于TGF-β1+DRAM1 siRNA組(p0.05)。相反地,E-cadherin mRNA和蛋白表達在TGF-β1+NC組、TGF-β1+DRAM1siRNA組較未轉染siRNA對照組顯著增高(p0.05),而TGF-β1+NC組中的E-cadherin mRNA表達顯著低于TGF-β1+DRAM1 siRNA組(p0.05)。結論:1.DRAM1參與了TGF-β1介導的細胞自噬和EMT過程2.DRAM1可調控細胞的自噬水平和EMT3.p62-twist作為自噬和EMT的連接橋梁,可能在DRAM1調控EMT中發(fā)揮一定的作用,具體機制仍需進一步研究
[Abstract]:......
【學位授予單位】：川北醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1353553