本文關(guān)鍵詞：DRAM1介導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用及其機制研究　出處：《川北醫(yī)學(xué)院》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：研究背景:肺癌的發(fā)病率和死亡率在全球各種惡性腫瘤中位居榜首。肺癌患者治療失敗的主要原因是發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移,如何抑制肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移是目前肺癌治療亟待解決的問題。研究發(fā)現(xiàn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)現(xiàn)象在上皮源性腫瘤細(xì)胞中普遍存在,其重要特征就是腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜E-cadherin、β-catenin等上皮標(biāo)記表達下調(diào),獲得間質(zhì)細(xì)胞表型,表達vimentin,細(xì)胞黏附能力減弱,遷移和侵襲能力增強。因此,探討EMT及其信號途徑在肺癌中的分子機制和逆轉(zhuǎn)策略具有重要的科學(xué)意義和臨床應(yīng)用前景。自噬(autophagy)是一種進化上保守的、維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的重要機制。其主要是通過形成雙層膜結(jié)構(gòu),將細(xì)胞內(nèi)需要被降解的蛋白或受損細(xì)胞器包裹起來,轉(zhuǎn)運至溶酶體進行降解,之后將降解產(chǎn)物被用作細(xì)胞生物合成和細(xì)胞器的更新,從而維持細(xì)胞的穩(wěn)定。目前研究表明,自噬的激活與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切的關(guān)系,通過調(diào)控自噬水平,可以影響腫瘤的增殖、凋亡、侵襲。因此,自噬成為腫瘤研究領(lǐng)域的熱點。損傷相關(guān)自噬調(diào)節(jié)因子(Damage-Regulated Autophagy Modulator,DRAM)是一類高度保守的基因,其公認(rèn)的作用是通過誘導(dǎo)自噬溶酶體的聚集,從而激活細(xì)胞自噬。DRAM家族中目前發(fā)現(xiàn)了5個基因,其中DRAM1是目前DRAM家族中最受關(guān)注的基因。既往研究表明DRAM1在肺癌等多種腫瘤組織呈低表達,其主要功能是調(diào)控自噬,誘導(dǎo)p53和p73依賴的自噬性凋亡。目前研究表明,調(diào)節(jié)自噬相關(guān)基因p62/sqstm1可影響腫瘤細(xì)胞的emt。此外,tgf-β1在誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞emt的同時,也影響了細(xì)胞內(nèi)的自噬流。上述結(jié)果提示自噬和emt直接關(guān)系密切。那么,作為自噬調(diào)節(jié)基因的dram1,是否可以通過調(diào)控p62/sqstm1進而影響肺癌細(xì)胞emt的作用呢?基于上述科學(xué)設(shè)想,本研究擬通過調(diào)控dram1表達,探討其對肺癌a549細(xì)胞自噬和emt的影響,以及其在tgf-β1誘導(dǎo)的emt中發(fā)揮作用和機制,初步闡述dram1在調(diào)控肺癌a549細(xì)胞emt中的作用和潛在的機制。實驗結(jié)果有望為肺癌侵襲和遷移的防治提供新的思路和潛在的治療靶標(biāo)。研究目的:1.明確dram1在調(diào)節(jié)a549細(xì)胞emt中的作用;2.探討dram1調(diào)節(jié)a549細(xì)胞emt的潛在機制。研究方法:1.培養(yǎng)a549細(xì)胞,應(yīng)用實時定量pcr檢測1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mltgf-β1分別處理24h和5ng/mltgf-β1分別處理12、24和48h后,a549細(xì)胞中內(nèi)源性dram1的表達情況;2.提取過表達質(zhì)粒pegfp-n1-dram1(dram1)和空載體pegfp-n1(vector)質(zhì)粒,并轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞。應(yīng)用免疫熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率,利用應(yīng)用實時定量pcr和westernblot檢測轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后,dram1、e-cadherin、vimentin、atg5、p62、twist以及l(fā)c3b的表達;3.應(yīng)用劃痕實驗和transwell小室,檢測轉(zhuǎn)染dram1質(zhì)粒后對a549細(xì)胞遷移能力的影響;4.5ng/mltgf-β1處理a549細(xì)胞24h后,利用實時定量pcr檢測atg5、p62和twistmrna的表達變化,并用westernblot檢測atg5、p62、twist以及l(fā)c3b蛋白的表達;5.轉(zhuǎn)染dram1sirna和sirna陰性對照(negativecontrol,nc)后,再用5ng/mltgf-β1處理a549細(xì)胞24h后,利用實時定量pcr和westernblot檢測e-cadherin、vimentin、p62和twist的表達;研究結(jié)果:1.用1ng/ml、2ng/ml、5ng/ml、10ng/mltgf-β1分別處理a549細(xì)胞后,dram1mrna的表達顯著高于未處理組(contorl,ctl)(p0.05);隨著重組人tgf-β1濃度逐漸升高(從1ng/ml到5ng/ml),dram1的表達也隨之升高(p0.05);5ng/ml組與10ng/ml組的dram1mrna的表達水平無顯著差異(p0.05)。應(yīng)用5ng/ml的tgf-β1分別處理a549細(xì)胞12、24h、48h后,發(fā)現(xiàn)dram1mrna的相對表達水平隨著時間的延長而增加(p0.05),呈時間依賴性。2.我們成功擴增和提取空載體pegfp-n1(vector)質(zhì)粒和pegfp-n1-dram1質(zhì)粒。將上述兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞48h后,使用熒光顯微鏡觀察到兩種質(zhì)粒均成功轉(zhuǎn)染進入a549細(xì)胞。pegfp-n1-dram1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞后,dram1、vimentin、atg5、p62、twist和lc3bii/i表達顯著高于未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照組和vector組(p0.05)。3.發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染pegfp-n1-dram1質(zhì)粒后,a549細(xì)胞的遷移的能力較未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒對照組和vector組顯著增強。4.使用5ng/ml重組人tgf-β1處理a549細(xì)胞24h后,qpcr檢測顯示atg5、p62和twistmrna表達水平較對照組顯著升高(p0.05);western blot檢測發(fā)現(xiàn),自噬相關(guān)蛋白LC3B、Atg5、p62以及Twist表達水平較對照組顯著升高(p0.05)。5.Twist、p62以及vimentin mRNA和蛋白表達在TGF-β1+NC組、TGF-β1+DRAM1 siRNA組較未轉(zhuǎn)染siRNA對照組顯著增高(p0.05),并且Twist、p62以及vimentin mRNA和蛋白表達在TGF-β1+NC組的水平高于TGF-β1+DRAM1 siRNA組(p0.05)。相反地,E-cadherin mRNA和蛋白表達在TGF-β1+NC組、TGF-β1+DRAM1siRNA組較未轉(zhuǎn)染siRNA對照組顯著增高(p0.05),而TGF-β1+NC組中的E-cadherin mRNA表達顯著低于TGF-β1+DRAM1 siRNA組(p0.05)。結(jié)論:1.DRAM1參與了TGF-β1介導(dǎo)的細(xì)胞自噬和EMT過程2.DRAM1可調(diào)控細(xì)胞的自噬水平和EMT3.p62-twist作為自噬和EMT的連接橋梁,可能在DRAM1調(diào)控EMT中發(fā)揮一定的作用,具體機制仍需進一步研究
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：川北醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R734.2

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本文編號：1353553